本發(fā)明涉及一種催化合成β-紫羅蘭酮的煙草類胡蘿卜素單加氧酶bcm及其在煙葉提質(zhì)上的應(yīng)用，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、在煙草工業(yè)中，煙葉的品質(zhì)與風(fēng)味是決定其市場(chǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因素之一。煙葉中的類胡蘿卜素，尤其是β-胡蘿卜素，作為重要的前體物質(zhì)，對(duì)煙葉的色澤、香氣及口感均有顯著影響。然而，自然條件下，β-胡蘿卜素在煙葉中的轉(zhuǎn)化效率較低，難以直接滿足高品質(zhì)煙草制品的需求。因此，開發(fā)一種能夠高效催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為更具價(jià)值的化合物，如β-紫羅蘭酮的酶類催化劑，對(duì)于提升煙葉品質(zhì)、豐富煙草風(fēng)味具有重要意義。現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶的研究已取得了一定進(jìn)展，但針對(duì)煙草特異性環(huán)境及需求的酶類催化劑仍較為稀缺。

2、霍氏腸桿菌作為一種廣泛存在于自然環(huán)境中的微生物，具有豐富的生物多樣性和潛在的生物活性物質(zhì)生產(chǎn)能力，其基因組中蘊(yùn)藏著大量未被充分發(fā)掘的基因資源，包括可能編碼高效酶類的基因。由于霍氏腸桿菌在適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境過程中進(jìn)化出了獨(dú)特的代謝機(jī)制，因此其產(chǎn)生的酶類往往具有高效、專一且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)。當(dāng)前，關(guān)于霍氏腸桿菌中某些酶序列的功能認(rèn)知尚屬空白，特別是這些酶如何應(yīng)用于提升煙葉品質(zhì)方面，更鮮有研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明從霍氏腸桿菌中發(fā)掘出一段特異性序列，該序列在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)被歸類為功能未知。經(jīng)過本發(fā)明的創(chuàng)新性研究與功能解析，揭示該序列編碼一種具有裂解β-胡蘿卜素活性的酶，將其命名為bcm。該酶能夠催化β-胡蘿卜素的裂解反應(yīng)，進(jìn)而生成β-紫羅蘭酮這一重要香氣物質(zhì)，在優(yōu)化煙葉品質(zhì)、提升煙草制品風(fēng)味等方面擁有廣闊應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明提供一種來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的酶(命名為bcm)、含有所述酶的重組質(zhì)粒或表達(dá)所述酶的重組工程菌在煙絲提質(zhì)上的應(yīng)用，所述酶具有降解類胡蘿卜素的活性，且所述酶的氨基酸序列具有如下特征中的至少一個(gè)：

3、(1)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有80％以上的序列相似性；

4、(2)將seq?id?no.1～10所示的任一序列，從氨基端開始的第1-869位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列；且與seq?id?no.1～10任一氨基酸序列的同源性達(dá)80％以上；

5、(3)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有98％以上的序列相似性；

6、(4)為seq?id?no.1～10中的任意一條氨基酸序列；

7、所述bcm可能為一種類胡蘿卜素單加氧酶。

8、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述提升煙葉品質(zhì)為提升煙葉的β-紫羅蘭酮含量、香氣質(zhì)、香氣量、透發(fā)感或生津感中的任一方面。

9、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述應(yīng)用為使用表達(dá)bcm的重組工程菌對(duì)煙絲進(jìn)行噴灑發(fā)酵處理。

10、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述應(yīng)用中重組工程菌與煙絲的比例為0.05～0.20g菌泥/100g煙絲，其中，菌泥的濃度為(1.30～3.55)×1010cfu/g。

11、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述應(yīng)用中發(fā)酵條件為溫度25～35℃、濕度65～75％，發(fā)酵時(shí)間為12～20h。

12、本發(fā)明還提供一種來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的酶、含有所述酶的重組質(zhì)?；虮磉_(dá)所述酶的重組工程菌在制備β-紫羅蘭酮上的應(yīng)用，所述酶具有降解類胡蘿卜素的活性，且所述酶的氨基酸序列具有如下特征中的至少一個(gè)：

13、(1)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有80％以上的序列相似性；

14、(2)將seq?id?no.1～10所示的任一序列，從氨基端開始的第1-869位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列；且與seq?id?no.1～10任一氨基酸序列的同源性達(dá)80％以上；

15、(3)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有98％以上的序列相似性；

16、(4)為seq?id?no.1～10中的任意一條氨基酸序列。

17、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述應(yīng)用通過轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮。

18、本發(fā)明還提供一種表達(dá)催化β-胡蘿卜素生產(chǎn)β-紫羅蘭酮的酶的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒插入了編碼來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的酶的核苷酸序列，其中，所述酶具有降解類胡蘿卜素的活性，且所述酶的氨基酸序列具有如下特征中的至少一個(gè)：

19、(1)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有80％以上的序列相似性；

20、(2)將seq?id?no.1～10所示的任一序列，從氨基端開始的第1-869位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列；且與seq?id?no.1～10任一氨基酸序列的同源性達(dá)80％以上；

21、(3)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有98％以上的序列相似性；

22、(4)為seq?id?no.1～10中的任意一條氨基酸序列。

23、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述重組質(zhì)粒通過將編碼bcm的基因克隆至表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)所獲得。

24、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述表達(dá)載體為ppiczαa。

25、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述重組質(zhì)粒通過將編碼所述的酶的基因克隆至載體ppiczαa的ecori和noti酶切位點(diǎn)之間，使目的基因序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接，得到表達(dá)重組質(zhì)粒。

26、本發(fā)明還提供一種產(chǎn)β-紫羅蘭酮的重組工程菌，所述重組工程菌表達(dá)來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的酶，其中，所述酶具有降解類胡蘿卜素的活性，且所述酶的氨基酸序列具有如下特征中的至少一個(gè)：

27、(1)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有80％以上的序列相似性；

28、(2)將seq?id?no.1～10所示的任一序列，從氨基端開始的第1-869位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列；且與seq?id?no.1～10任一氨基酸序列的同源性達(dá)80％以上；

29、(3)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有98％以上的序列相似性；

30、(4)為seq?id?no.1～10中的任意一條氨基酸序列。

31、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述重組工程菌的宿主細(xì)胞為酵母菌。

32、作為本發(fā)明的一種可選方式，所述重組工程菌的宿主細(xì)胞為釀酒酵母或畢赤酵母。

33、本發(fā)明還提供一種催化β-胡蘿卜素生產(chǎn)β-紫羅蘭酮的生物制劑，所述生物制劑的活性成分含有來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的酶或表達(dá)所述酶的重組工程菌，其中，所述酶具有降解類胡蘿卜素的活性，且所述酶的氨基酸序列具有如下特征中的至少一個(gè)：

34、(1)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有80％以上的序列相似性；

35、(2)將seq?id?no.1～10所示的任一序列，從氨基端開始的第1-869位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列；且與seq?id?no.1～10任一氨基酸序列的同源性達(dá)80％以上；

36、(3)與seq?id?no.1～10所示的任一氨基酸序列具有98％以上的序列相似性；

37、(4)為seq?id?no.1～10中的任意一條氨基酸序列。

38、有益效果：

39、本發(fā)明首次揭示了來源于霍氏腸桿菌(enterobacter?hormaechei)的bcm序列在β-紫羅蘭酮生物合成中的關(guān)鍵作用，填補(bǔ)了該領(lǐng)域研究的空白；利用bcm序列構(gòu)建的重組工程菌具有高效、穩(wěn)定的β-紫羅蘭酮生產(chǎn)能力，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能；將表達(dá)bcm的重組工程菌應(yīng)用在煙葉發(fā)酵中，可提升煙葉中β-紫羅蘭酮含量，提升煙葉的抽吸品質(zhì)，包括香氣質(zhì)、香氣量、透發(fā)感和生津感等，在煙葉發(fā)酵及品質(zhì)提升領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，有望推動(dòng)煙草行業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)。

40、綜上所述，本發(fā)明不僅豐富了來源于霍氏腸桿菌的單加氧酶家族的功能認(rèn)知，更為煙草制品的香氣改良與品質(zhì)提升提供了強(qiáng)有力的生物技術(shù)支持，具有顯著的理論價(jià)值與實(shí)踐意義。