本發(fā)明涉及一株暹羅芽孢桿菌g12、菌劑、制備方法、及在提升煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、在卷煙工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，各地?zé)熑~以其獨(dú)特的地域特色被卷煙廠按需采購(gòu)。然而，由于煙葉收購(gòu)時(shí)質(zhì)量參差不齊，常導(dǎo)致部分煙葉難以進(jìn)入卷煙配方之中。為處理這些不適用或難適用的煙葉，煙草企業(yè)需承擔(dān)高額費(fèi)用，且這些煙葉或因長(zhǎng)期庫(kù)存而面臨廢棄風(fēng)險(xiǎn)，或因囤積倉(cāng)庫(kù)而耗費(fèi)大量人力物力，嚴(yán)重制約了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，工業(yè)企業(yè)庫(kù)存積壓了大量此類煙葉，如何高效利用這些難適用煙葉已成為卷煙行業(yè)亟待破解的緊迫課題。

2、且煙葉在儲(chǔ)存過程中易受霉菌侵害，導(dǎo)致品質(zhì)下降、口感變差，甚至產(chǎn)生有害毒素，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康。傳統(tǒng)防治方法如化學(xué)殺菌劑的使用，雖能有效控制霉菌，但可能帶來環(huán)境污染和安全隱患。

3、煙堿是煙草中的主要生物堿，其含量直接影響煙草的口感和刺激性。高煙堿含量不僅可能引發(fā)健康問題，還限制了煙草產(chǎn)品的適用范圍。煙葉中含有大量的蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、纖維素和木質(zhì)素等大分子化合物，這些物質(zhì)的存在影響了煙草的燃燒性能和感官品質(zhì)。通過相關(guān)微生物的降解作用，可以將這些大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子化合物，增加香氣成分的含量，從而改善煙葉的品質(zhì)，降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生，提高煙草的吸濕性、燃燒性和口感，同時(shí)有利于后續(xù)加工處理。

4、通過微生物發(fā)酵減少煙葉的刺激性，增加其柔和度與香氣復(fù)雜度，這一過程通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間。關(guān)于微生物發(fā)酵煙葉的現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)酵方法通常需要至少48小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這不僅增加了生產(chǎn)成本，還限制了生產(chǎn)效率和產(chǎn)能的快速提升。

5、綜上，盡管已有一些研究嘗試引入微生物發(fā)酵技術(shù)來改進(jìn)煙葉發(fā)酵過程，但大多數(shù)方法仍面臨發(fā)酵效果不穩(wěn)定、發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)、生產(chǎn)效率不高等問題。因此，篩選并培育一種新型微生物菌株，以抑制煙葉表面霉菌、降低煙堿含量，高效催化煙葉內(nèi)部關(guān)鍵化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化、提升煙葉的香氣和口感，大幅縮短發(fā)酵時(shí)間，不僅能夠顯著提高煙草生產(chǎn)的效率，降低生產(chǎn)成本，提高煙草品質(zhì)，還有望為煙草行業(yè)帶來更加環(huán)保、高效的生產(chǎn)模式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供了一株暹羅芽孢桿菌(bacillus?siamensis)、其菌劑，及其在提升煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用，該暹羅芽孢桿菌可抑制煙葉霉菌、降低煙堿含量，能夠降低煙葉中的蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、果膠等大分子化合物的含量，顯著提高煙葉的感官品質(zhì)；發(fā)酵煙葉時(shí)可大幅縮短發(fā)酵時(shí)間，能夠顯著提高煙草生產(chǎn)的效率，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌能夠有效利用不適用或難適用煙葉，解決煙葉的質(zhì)量問題及儲(chǔ)存問題。

2、本發(fā)明的采用的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株暹羅芽孢桿菌(bacillus?siamensis)，已于2024年9月6日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.31893。

4、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述暹羅芽孢桿菌分離自云南宣威2022年的c3f-ab煙葉中，命名為暹羅芽孢桿菌g12。

5、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌的16s?rdna的核苷酸序列具有如seq?id?no.3所示的序列。

6、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893具有以下生物學(xué)特性：

7、(1)為革蘭氏陽性菌，菌株大小為0.5-0.8μm×1.2-1.8μm，呈細(xì)桿狀，無鞭毛，在平板上菌落較大，表面粗糙有凸起，扁平，邊緣不規(guī)則；

8、(2)生長(zhǎng)溫度范圍為28～37℃，能夠耐受0～14.5％nacl，生長(zhǎng)ph范圍為4.5～9.5；

9、(3)屬于兼性需氧菌，在有氧無氧條件均生長(zhǎng)良好；

10、(4)可抑制煙葉表面霉菌，抑制率可達(dá)80％；

11、(5)具有降低煙堿的能力，對(duì)1g/l濃度的煙堿降解率高達(dá)98.6％；

12、(6)可降低煙葉中蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、木質(zhì)素、纖維素含量；

13、(7)改善煙葉吸食品質(zhì)。

14、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種微生物菌劑，含有本發(fā)明的暹羅芽孢桿菌cgmccno.31893。

15、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物菌劑以暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893為主要微生物。

16、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌劑中暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893的細(xì)胞數(shù)量不低于3.0×108cfu/ml。

17、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌劑，是制備暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893的種子液，然后擴(kuò)培得到的。

18、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌劑為固態(tài)菌劑或液態(tài)菌劑。

19、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物菌劑含有本發(fā)明的cgmcc?no.31893菌株的菌體活細(xì)胞、冷凍干燥得到的本發(fā)明的cgmcc?no.31893菌株的干菌體、固定化的本發(fā)明的cgmcc?no.31893菌株的細(xì)胞，或者以其他任何形式存在的本發(fā)明的cgmcc?no.31893菌株。

20、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種抑制煙葉霉菌、降低煙堿、降低煙葉中大分子化合物或提升煙葉品質(zhì)的方法，所述方法利用暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893或含有所述cgmcc?no.31893微生物菌劑發(fā)酵煙葉以提升煙葉品質(zhì)。

21、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：

22、(1)將暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893菌懸液噴灑到煙葉表面后發(fā)酵；

23、(2)將發(fā)酵好的煙葉烘干，獲得發(fā)酵煙葉。

24、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)中所述菌懸液按照(1.0～1.8)×108cfu/g噴灑到煙葉表面；

25、優(yōu)選地，所述菌懸液按照1.2×108cfu/g噴灑到煙葉表面。

26、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵溫度為30～37℃、濕度為60％～80％，發(fā)酵時(shí)間為4～48h；

27、優(yōu)選地，所述發(fā)酵時(shí)間為24h。

28、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(2)中所述烘干溫度為45～55℃；所述發(fā)酵煙葉含水量為1.0％～1.2％。

29、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述煙葉中大分子化合物為蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、木質(zhì)素或纖維素。

30、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893或含有所述cgmccno.31893微生物菌劑在制備煙草制品中的應(yīng)用。

31、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的煙草制品為煙用香料、煙草浸膏、烤煙煙葉或雪茄煙葉等。

32、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種用于所述暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893的發(fā)酵培養(yǎng)基。

33、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：碳源5g/l-15g/l、復(fù)合氮源10g/l-20g/l、2.5g/l-7.5g/l的(nh4)2so4、3g/l-4g/l的kh2po4、5g/l-6g/l的k2hpo4；所述發(fā)酵培養(yǎng)基溶劑為水。

34、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：碳源15g/l，復(fù)合氮源10g/l，(nh4)2so4?5g/l，3g/l?kh2po4，5.5g/l?kh2po4；所述發(fā)酵培養(yǎng)基溶劑為水。

35、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述碳源為葡萄糖、麥芽糊精、阿拉伯糖、蔗糖中的一種或多種。

36、優(yōu)選地，所述碳源為麥芽糊精。

37、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合氮源為酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母蛋白胨、酸水解酪蛋白中的兩種或兩種以上的組合。

38、優(yōu)選地，所述復(fù)合氮源由酵母粉和大豆蛋白胨按重量比1：1組成。

39、本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種所述暹羅芽孢桿菌cgmcc?no.31893的干燥方法，具體實(shí)施步驟包括：將所述暹羅芽孢桿菌菌泥加水重懸離心，得到清洗后的菌泥；再次重懸菌泥并加入凍干保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干菌粉。

40、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述凍干保護(hù)劑為蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一種或多種；

41、優(yōu)選地，所述凍干保護(hù)劑為蔗糖。

42、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌泥與凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比為10：(1～4)；

43、優(yōu)選地，所述質(zhì)量比為10：1。

44、生物材料保藏

45、暹羅芽孢桿菌(bacillus?siamensis)g12，分類學(xué)命名為：暹羅芽孢桿菌bacillussiamensis，已于2024年9月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.31893，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

46、有益效果：

47、本發(fā)明提供了一株暹羅芽孢桿菌，能夠抑制煙葉中的霉菌，能降解煙堿，可在煙葉環(huán)境中良好的生存代謝；對(duì)影響難適用或不適用煙葉的品質(zhì)、燃燒性和健康安全性的大分子化合物具有非常良好的降解效果，可有效改善煙葉抽吸品質(zhì)，加速煙葉發(fā)酵，節(jié)約煙葉發(fā)酵時(shí)間，大大提高煙葉尤其是低次品質(zhì)的煙葉的可用性，具體而言：

48、(1)本發(fā)明篩選獲得并保藏的暹羅芽孢桿菌g12具有降解煙葉中蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、木質(zhì)素、纖維素等大分子物質(zhì)的能力，對(duì)蛋白質(zhì)的降解率可達(dá)32.81％，對(duì)果膠的降解率可達(dá)28.41％，對(duì)木質(zhì)素的降解率可達(dá)25.48％；

49、(2)本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌g12能夠抑制煙葉表面霉菌，抑菌率可達(dá)80％；

50、(3)本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌g12具有降低煙堿的能力，對(duì)1g/l濃度煙堿的降解率為98.6％，能在高達(dá)5g/l尼古丁濃度下生長(zhǎng)，對(duì)2.5g/l濃度煙堿的降解率為66.8％；

51、(4)經(jīng)本發(fā)明菌株發(fā)酵后的煙葉的香氣量、透發(fā)性以及生津感得到提升，雜氣和刺激性降低，顯著改善煙葉品質(zhì)；

52、(5)采用本發(fā)明提供的暹羅芽孢桿菌g12進(jìn)行煙葉發(fā)酵應(yīng)用時(shí)，發(fā)酵時(shí)間大大縮短，僅需24h就能達(dá)到理想的評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)，提高了生產(chǎn)效率。