本發(fā)明涉及生物基因，具體涉及一種水稻epsps突變型蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雜草是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，化學(xué)除草是控制稻田雜草的主要措施，常規(guī)除草劑因其作用機(jī)制不同而有不同的殺草譜，但是雜草的防治一直是個(gè)難點(diǎn)，主要原因是雜草在分類學(xué)和生理學(xué)上都與水稻十分相似，除草劑使用不當(dāng)會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生重大藥害。近年提出配套使用專用除草劑和抗除草劑水稻品種來(lái)控制稻田雜草的防治策略，因而抗除草劑水稻受到越來(lái)越多的關(guān)注，并成為遺傳育種的一個(gè)重要方向。

2、草甘膦是迄今為止最為重要、應(yīng)用最廣泛和最優(yōu)秀的除草劑之一。然而,由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的廣泛商業(yè)化導(dǎo)致草甘膦使用量迅速增長(zhǎng),雜草抗藥性發(fā)生,這不僅對(duì)草甘膦的藥效發(fā)揮和未來(lái)可持續(xù)應(yīng)用造成了嚴(yán)重影響,而且對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全構(gòu)成了威脅。草甘膦是目前世界上使用的最為廣泛的除草劑之一，至今已使用了近四十年。

3、草甘膦的作用機(jī)理主要是競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)的活性。該合成酶是真菌、細(xì)菌、藻類、高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸生物合成過程中一個(gè)關(guān)鍵酶。一般情況下草甘膦能夠很好的結(jié)合天然的epsps，研究發(fā)現(xiàn)個(gè)別epsps突變體與草甘膦的結(jié)合能力下降，能夠耐受草甘膦。目前培育抗草甘膦品種的方法是應(yīng)用基因工程手段將來(lái)自細(xì)菌的抗草甘膦基因?qū)朕r(nóng)作物中，從而培育出轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物新品種。1996年開始推廣以來(lái)，種植面積迅速增加，至2015年，全球抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.5億公頃，占轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的83％，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境帶來(lái)了巨大利益。但是，目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最廣的抗草甘膦基因是來(lái)源于農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)cp4菌株的cp4epsps。雖然先后從微生物中發(fā)現(xiàn)了許多能抗草甘膦的epsps基因，但這些基因在農(nóng)作物中尚未得到廣泛應(yīng)用。這些微生物抗草甘膦基因在農(nóng)作物中的應(yīng)用是將這些基因如cp4epsps，用轉(zhuǎn)基因的方法在農(nóng)作物中表達(dá)。目前已在抗草甘膦的牛筋草中找到了一些epsps蛋白的變異體，但目前難以在作物體內(nèi)獲得天然突變的抗草甘膦的epsps基因，只能通過轉(zhuǎn)基因的方式，將突變的epsps基因轉(zhuǎn)入作物體內(nèi)，獲得抗草甘膦作物。但由于轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管政策及轉(zhuǎn)基因作物在全世界的接受程度，其大規(guī)模的推廣和使用仍受到較多的限制。因此，急需開發(fā)不影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，且對(duì)植物具有草甘膦抗性的基因，對(duì)水稻等作物生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻epsps突變型蛋白及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的水稻epsps突變蛋白不僅能夠提高水稻的抗除草劑性能，還能保持水稻產(chǎn)量、株高等農(nóng)藝性狀的穩(wěn)定，因此可以用于培育抗草甘膦作物。

2、為此，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案，

3、第一方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種水稻epsps突變型蛋白，所述水稻epsps突變型蛋白為野生型epsps蛋白在氨基酸序列上第169位發(fā)生了突變，由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。

4、優(yōu)選的，所述水稻epsps突變型蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、第二方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種水稻epsps突變型基因，所述水稻epsps突變型基因?yàn)橐吧蚭psps基因在核苷酸序列上第506位發(fā)生了突變，由c突變?yōu)間。

6、優(yōu)選的，所述水稻epsps突變型基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、第506位c突變成g、導(dǎo)致了epsps基因編碼氨基酸的第169位由蘇氨酸(t)突變?yōu)榻z氨酸(s)，該水稻epsps突變體具有草甘膦抗性，同時(shí)保持了自身的生物酶催化活性，轉(zhuǎn)化該水稻epsps突變體的植株能夠正常生長(zhǎng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

8、第三方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種核酸分子，編碼上述水稻epsps突變型蛋白。

9、第四方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有上述水稻epsps突變型蛋白、上述水稻epsps突變型基因或上述核酸分子。

10、第五方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種重組載體，所述重組載體含有上述水稻epsps突變型蛋白、上述水稻epsps突變型基因或上述核酸分子。

11、第六方面，本發(fā)明在可選的實(shí)施方式中提供了一種上述水稻epsps突變型蛋白、上述水稻epsps突變型基因、上述核酸分子、上述表達(dá)盒或上述重組載體在使目標(biāo)植物具有抗/耐草甘膦抗性中的應(yīng)用。

12、優(yōu)選的，使目標(biāo)植物具有抗/耐草甘膦抗性的方法包括：

13、(1)將編碼所述水稻epsps突變型蛋白的序列或所述水稻epsps突變型基因?qū)肽繕?biāo)植物中；或，

14、(2)將所述水稻epsps突變型基因或所述水稻epsps突變型蛋白培育純合的植物子代或植物種子。

15、更進(jìn)一步的，將所述水稻epsps突變型基因?qū)肽繕?biāo)植物的方法包括雜交、回交、轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)。

16、具體而言，所述應(yīng)用包括以下步驟：

17、(1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來(lái)，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級(jí)愈傷組織；

18、(2)將次級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)；

19、(3)將步驟(2)中獲得的愈傷組織與農(nóng)桿菌接觸15分鐘獲得抗性愈傷，該農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入了具有植物抗除草劑epsps突變型基因或編碼所述突變蛋白的其他基因的重組表達(dá)載體；

20、(4)將步驟(3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到其上墊有三張無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，21-23℃培養(yǎng)48小時(shí)；

21、(5)將步驟(4)的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天；

22、(6)將步驟(5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；

23、(7)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和

24、(8)將步驟(7)的苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。

25、所述seq?id?no.1的核苷酸序列如下所示。

26、atggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctcgtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgcgggggcggcgggaggcggtggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggagatctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggatgttcactacatgcttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaagtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaagtgcaatgcgaccattgacagcagccgtgactgctgctggtggaaatgcaacttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggttgtcgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaattggaggacttcctggtggcaaggttaagctctctggttccatcagcagtcagtacttgagtgccttgctgatggctgctcctttggcccttggggatgtggagatcgaaatcattgacaaactaatctccattccttacgttgaaatgacattgagattgatggagcgttttggtgtgaaggcagagcattctgatagttgggacagattctatattaagggagggcagaagtacaaatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgatgcctcaagcgcgagctatttcttggctggtgctgcaatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacaccagtgtaaccgtaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcctgatgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgctgatggtccaactgctatcagagatgtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaaggatggttgcaattcggaccgagctaacaaagctgggagcatcggttgaagaaggtcctgactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatggccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttcgacgttctaagcactttcgtcaggaactga。

27、所述seq?id?no.2的氨基酸序列如下所示。

28、masnaaaaaavsldqavaasaafssrkqlrlpaaarggmrvrvrargrreavvvasassssvaapaakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnllnsedvhymlealkalglsveadkvakravvvgcggkfpvekdakeevqlflgnagsamrpltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtlrlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn。