本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)，具體涉及一種適于花葉海棠干旱脅迫熒光定量內(nèi)參基因及其引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、花葉海棠(malus?transitoria)為薔薇科蘋果屬灌木，耐鹽堿、干旱、荒漠，常在綠化造林中用作水土保持的樹種，在我國西北等地體現(xiàn)出較高的生態(tài)價(jià)值，也是中國特有植物，在西藏和青海以及四川被用作制作藏茶的原料，具有較高的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

2、在研究目標(biāo)基因表達(dá)量時(shí)需要使用內(nèi)參基因。常用的內(nèi)參基因在不同的植物的不同組織，不同發(fā)育階段以及不同的脅迫處理，例如鹽堿脅迫，干旱脅迫和重金屬脅迫等實(shí)驗(yàn)條件下會(huì)表現(xiàn)不穩(wěn)定的性狀，從而影響目的基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3、目前還沒有專門用于花葉海棠研究的內(nèi)參基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)的發(fā)明人對(duì)花葉海棠進(jìn)行研究，從中篩選出表達(dá)穩(wěn)定的候選基因，對(duì)候選基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，獲得了適用花葉海棠的內(nèi)參基因，而且這些內(nèi)參基因即使在不同程度的干旱脅迫下表達(dá)也穩(wěn)定，仍然適合作為內(nèi)參基因。進(jìn)一步，以這些基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選開發(fā)了適合實(shí)時(shí)熒光定量pcr的引物。本發(fā)明填補(bǔ)了花葉海棠沒有內(nèi)參基因的空白，為花葉海棠甚至是蘋果屬植物的基因表達(dá)水平的研究提供有力支持，提高研究的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

2、基于以上，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案，請(qǐng)求給予保護(hù)：

3、本發(fā)明提供了如下(1)-(7)任意所述的內(nèi)參基因：

4、(1)如下(a)或(b)或(c)所示的內(nèi)參基因：

5、(a)：seq?id?no:1所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?id?no:1所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:1所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?idno:1所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:1所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

6、(b)：(a)中所述內(nèi)參基因的截取片段且該截取片段能被特異性擴(kuò)增；

7、(c)：seq?id?no:1中第845至1103位核苷酸所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?id?no:1中第845至1103位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:1中第845至1103位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?id?no:1中第845至1103位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:1中第845至1103位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

8、(2)如下(d)或(e)或(f)所示的內(nèi)參基因：

9、(d)：seq?id?no:2所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?id?no:2所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:2所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?idno:2所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:2所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

10、(e)：(d)中所述多核苷酸的截取片段且該截取片段能被特異性擴(kuò)增；

11、(f)：seq?id?no:2中第1128至1401位核苷酸所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?idno:2中第1128至1401位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:2中第1128至1401位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?id?no:2中第1128至1401位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:2中第1128至1401位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

12、(3)如下(g)或(h)或(i)所示的內(nèi)參基因：

13、(g)：seq?id?no:3所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?id?no:3所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:3所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?idno:3所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:3所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

14、(h)：(g)中所述多核苷酸的截取片段且該截取片段能被特異性擴(kuò)增；

15、(i)：seq?id?no:3中第1874至2179位核苷酸所示的內(nèi)參基因；或序列與seq?idno:3中第1874至2179位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性的多核苷酸，或來源于蘋果屬且與seq?id?no:3中第1874至2179位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸，或序列與seq?id?no:3中第1874至2179位核苷酸所示的內(nèi)參基因的序列具有95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上相似性且來源于蘋果屬且與seq?id?no:3中第1874至2179位核苷酸所示的內(nèi)參基因是天然等位基因的多核苷酸；

16、(4)內(nèi)參基因組合物：由(1)所示內(nèi)參基因和上述(2)所示內(nèi)參基因組成；

17、(5)內(nèi)參基因組合物：由(1)所示內(nèi)參基因和上述(3)所示內(nèi)參基因組成；

18、(6)內(nèi)參基因組合物：由(2)所示內(nèi)參基因和上述(3)所示內(nèi)參基因組成；

19、(7)內(nèi)參基因組合物：由(1)所示內(nèi)參基因和上述(2)所示內(nèi)參基因和上述(3)所示內(nèi)參基因組成。

20、上述內(nèi)參基因中，所述蘋果屬優(yōu)選為花葉海棠。

21、本發(fā)明從花葉海棠中分離獲得cdna序列如seq?id?no:1或seq?id?no:2或seq?idno:3所示的內(nèi)參基因，進(jìn)一步選取了其中的一個(gè)片段作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案里涉及的內(nèi)參基因，并不僅指seq?id?no:1或seq?id?no:2或seq?idno:3所示的基因或其片段，還應(yīng)包括與seq?id?no:1或seq?id?no:2或seq?id?no:3所示基因或其片段為等位基因的天然等位基因或其片段。根據(jù)本領(lǐng)公知常識(shí)，由于自然變異的存在，天然等位基因之間往往會(huì)存在一些序列差異，導(dǎo)致天然等位基因之間的序列相似性可能是95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上。當(dāng)然，這些天然等位基因之間的功能是相同的，即在正常條件下以及干旱脅迫條件下其表達(dá)水平穩(wěn)定，可以用作內(nèi)參基因使用。

22、上述的天然等位基因，是存在于植物中的且未經(jīng)任何人工改造的等位基因。上述天然等位基因，可以來源于花葉海棠(malus?transitoria)，具體的可以來源于花葉海棠(malus?transitoria)的自然個(gè)體，即野生資源，或來源于花葉海棠(malus?transitoria)的不同品種，即人工改造的資源。上述天然等位基因，可以來源于蘋果屬內(nèi)其它物種的植物，或是其自然個(gè)體，即野生資源，或是其不同品種，即人工改造的資源。

23、上述內(nèi)參基因中，涉及序列相似性的描述包括基因組dna序列的序列相似性，也包括cdna序列的序列相似性。

24、上述各技術(shù)方案中，特異擴(kuò)增是指以蘋果屬植物或花葉海棠(malustransitoria)的dna或rna為模版，用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物是目標(biāo)特異性片段(如所述截取片段)，理論上不含有其它片段。當(dāng)然實(shí)踐操作中，由于各種不可控原因，也可能含有一些其它片段，但是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的認(rèn)知里，是可以接受的，不影響特異性片段的識(shí)別和使用即可。

25、上述任一所述的內(nèi)參基因適用于蘋果屬內(nèi)任何物種的基因表達(dá)水平檢測(cè)。既可在某個(gè)或某幾個(gè)物種的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，也可在整個(gè)蘋果屬的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。作為一個(gè)具體例子，用于花葉海棠(malus?transitoria)的基因表達(dá)水平檢測(cè)。

26、上述內(nèi)參基因可以用于常規(guī)狀態(tài)下(即無任何脅迫條件)的植物中基因表達(dá)水平的檢測(cè)，也可以適用于不同程度干旱脅迫條件下的植物中基因表達(dá)水平的檢測(cè)。

27、優(yōu)選的，所述檢測(cè)植物基因表達(dá)水平的方法為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

28、本發(fā)明提供如下任意所述引物對(duì)或引物對(duì)組合：

29、(1)擴(kuò)增上述(1)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)；

30、(2)擴(kuò)增上述(2)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)；

31、(3)擴(kuò)增上述(3)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)；

32、(4)上述(1)所示引物對(duì)和上述(2)所示引物對(duì)的組合；

33、(5)上述(1)所示引物對(duì)和上述(3)所示引物對(duì)的組合；

34、(6)上述(2)所示引物對(duì)和上述(3)所示引物對(duì)的組合；

35、(7)上述(1)所示引物對(duì)和上述(2)所示引物對(duì)和和上述(3)所示引物對(duì)的組合。

36、擴(kuò)增上述(1)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)為：如seq?id?no:4和seq?id?no:5所示的引物對(duì)，或者，為擴(kuò)增上述(c)所述內(nèi)參基因、且上游引物序列與seq?id?no:4具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性、和下游引物序列與seq?id?no:5具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性的引物對(duì)；

37、擴(kuò)增上述(2)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)為：如seq?id?no:6和seq?id?no:7所示的引物對(duì)，或者，為擴(kuò)增上述(f)所述內(nèi)參基因、且上游引物序列與seq?id?no:6具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性、和下游引物序列與seq?id?no:7具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性的引物對(duì)；

38、擴(kuò)增上述(3)所述內(nèi)參基因的引物對(duì)為：如seq?id?no:8和seq?id?no:9所示的引物對(duì)；或者，為擴(kuò)增上述(i)所述內(nèi)參基因、且上游引物序列與seq?id?no:8具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性、和下游引物序列與seq?id?no:9具有98％以上、99％以上、99.5％以上相似性的引物對(duì)。。

39、其中，上述任意所述引物對(duì)或引物對(duì)組合是用于檢測(cè)植物基因表達(dá)水平時(shí)擴(kuò)增相應(yīng)內(nèi)參基因的引物對(duì)。

40、上述任意所述引物對(duì)或引物對(duì)組合適用于蘋果屬內(nèi)任何物種的基因表達(dá)水平檢測(cè)。既可在某個(gè)或某幾個(gè)物種的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，也可在整個(gè)蘋果屬的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。作為一個(gè)具體例子，用于花葉海棠(malus?transitoria)的基因表達(dá)水平檢測(cè)。

41、上述引物對(duì)或引物對(duì)組合所擴(kuò)增的內(nèi)參基因?yàn)檫m用于檢測(cè)植物在干旱脅迫條件下或無任何脅迫條件下基因表達(dá)水平時(shí)使用的內(nèi)參基因。

42、優(yōu)選的，所述檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

43、上述任意所述內(nèi)參基因在檢測(cè)植物基因表達(dá)水平中的應(yīng)用也是本發(fā)明提供的技術(shù)方案。

44、上述任意所述的引物對(duì)或引物對(duì)組合在檢測(cè)植物基因表達(dá)水平中的應(yīng)用也是本發(fā)明提供的技術(shù)方案。

45、該應(yīng)用技術(shù)方案中，所述植物為蘋果屬內(nèi)的任何植物；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述植物為花葉海棠(malus?transitoria)。

46、該應(yīng)用技術(shù)方案中，既可在某個(gè)或某幾個(gè)物種的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，也可在整個(gè)蘋果屬的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

47、該應(yīng)用技術(shù)方案中，可以是檢測(cè)常規(guī)狀態(tài)下(即無任何脅迫條件)的植物中基因表達(dá)水平，也可以是檢測(cè)不同程度干旱脅迫條件下的植物中基因表達(dá)水平。

48、優(yōu)選的，所述檢測(cè)植物基因表達(dá)水平的方法為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

49、本發(fā)明還提供一種檢測(cè)植物基因表達(dá)水平的方法，包括如下(a)或(b)所示步驟：

50、(a)以上述任一所述內(nèi)參基因作為內(nèi)參基因；

51、(b)以上述任一所述所述的引物對(duì)或引物對(duì)組合作為擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物。

52、該方法技術(shù)方案中，所述植物為蘋果屬內(nèi)的任何植物；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述植物為花葉海棠(malus?transitoria)。

53、該方法技術(shù)方案中，既可在蘋果屬的某個(gè)或某幾個(gè)物種的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，也可在整個(gè)蘋果屬的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

54、該方法技術(shù)方案中，可以是檢測(cè)常規(guī)狀態(tài)下(即無任何脅迫條件)的植物中基因表達(dá)水平，也可以是檢測(cè)不同程度干旱脅迫條件下的植物中基因表達(dá)水平。

55、優(yōu)選的，所述檢測(cè)植物基因表達(dá)水平的方法為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

56、本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
中的任何一處所述的“干旱脅迫條件”可以指自然干旱條件，也可以指任何人為制造的干旱條件，不做限制，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。另外，對(duì)干旱程度也不做限制，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為的屬于干旱條件就屬于本發(fā)明所述的“干旱脅迫條件”。

57、檢測(cè)基因表達(dá)水平：其中的基因包括編碼蛋白或功能性rna分子的基因、起調(diào)控元件作用的基因、和其它任何基因。既可以指dna層面的檢測(cè)，也可以是rna層面上的檢測(cè)。表達(dá)水平一般指表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量或絕對(duì)表達(dá)量，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行，不做限制。

58、本文中seq?id?no:1、seq?id?no:2和seq?id?no:3均是指基因的cdna序列。本領(lǐng)域公知，可以用基因組dna序列描述基因，也可以用cdna序列描述基因，二者實(shí)質(zhì)是相同的，二者限定的基因是相同的同一個(gè)基因。雖然本發(fā)明用seq?id?no:1、seq?id?no:2和seq?idno:3這些cdna序列描述內(nèi)參基因，但其所限定的內(nèi)參基因并不拘泥于這些具體序列，如果用基因組dna序列進(jìn)行描述，只要其描述的基因與本發(fā)明的內(nèi)參基因是同一個(gè)內(nèi)參基因，則也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

59、本發(fā)明以花葉海棠為樣本，研究其在干旱脅迫條件下以及非脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定的基因作為候選內(nèi)參基因，依次通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，普通pcr分析，熒光定量pcr分析，擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析，利用genorm、normfinder和bestkeeper和delta?ct值四種方法對(duì)這些內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析排序，篩選出干旱脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因作為內(nèi)參基因。并以這些基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，填補(bǔ)了花葉海棠沒有內(nèi)參基因的現(xiàn)狀，為花葉海棠抗旱相關(guān)功能基因的精確定量提供有力支持，可提高研究的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，具有重要意義。