本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及促甲狀腺激素受體的突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating?hormonereceptor,tshr存在于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和其他多種細(xì)胞的質(zhì)膜上，是一種7次跨膜糖蛋白受體，屬于g蛋白偶聯(lián)受體。tshr能和促甲狀腺激素(thyroid-stimulating?hormone,ts?h)結(jié)合，是t淋巴細(xì)胞和自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune?thyroiddisease,aitd)tshr抗體(tshr?antibody,trab)最常見的抗原靶點(diǎn)。tshr共764個氨基酸，分為膜內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和膜外區(qū)；膜外區(qū)含有418個氨基酸，是tsh和trab的識別和結(jié)合部位。tshr胞外區(qū)(ecd)：11個半胱氨酸，5對二硫鍵。

2、人體內(nèi)主要有三種與tshr相關(guān)的抗體：tsab：能激活tsh類似tsh的生物效應(yīng)，引起甲狀腺功能亢進(jìn)，自身抗體表位6-168aa；tsbab：與tshr結(jié)合后阻斷tsh與受體的結(jié)合并抑制tsh的生物學(xué)效應(yīng)，引起甲狀腺功能減退；自身抗體表位261-370aa；中性tsh受體抗體：既不激活也不阻斷其它配體對tshr的作用。

3、tshr自身抗體檢測臨床意義：anti-tshr是甲狀腺細(xì)胞膜tsh受體的自身抗體，具有和tsh相似的甲狀腺刺激功能，不受負(fù)反饋系統(tǒng)的控制，刺激甲狀腺功能trab是引起graves病患者甲亢和甲亢復(fù)發(fā)的重要原因之一。graves病患者用藥療效評估，抗甲狀腺藥物治療期間trab濃度下降可能提示病情緩解，是評價停藥時機(jī)及預(yù)測復(fù)發(fā)的重要指征。妊娠期婦女甲狀腺功能紊亂的風(fēng)險(xiǎn)評估，血清trab的測定有助于指導(dǎo)妊娠過程孕婦甲狀腺功能紊亂的控制，有助于評估妊娠結(jié)局

4、tshr為7次跨膜蛋白，抗原和抗體的結(jié)合依賴抗原構(gòu)象活性，因此成功表達(dá)具有活性的抗原頗具挑戰(zhàn)。目前tshr采用細(xì)胞直接使用去垢劑粗提，檢測試劑因精密性較差，尤其是低值區(qū)界值(≤2.0iu/l)附近濃度變異較大在10％～12％左右，較差儀器能到16％，導(dǎo)致界值附近樣本初復(fù)測不一致，出現(xiàn)陰陽反差。主要原因有兩方面：一個是低值區(qū)反應(yīng)梯度較小，另一個是發(fā)光值變異較大(常規(guī)表現(xiàn)2.5％～5％)。反應(yīng)梯度主要受原材料tshr的限制；發(fā)光值變異較大的原因之一為試劑溫敏，主要是tshr的穩(wěn)定性差導(dǎo)致，當(dāng)溫育盤變化±1℃，信號值偏差在15％-20％，濃度值偏差較大，界值附近偏差約50％，在溫控效果較差的儀器上表現(xiàn)更明顯；另一個原因可能是在粗純tshr為粗品，且效價低，投料比例高(1/25～1/30)，可能引入一些雜質(zhì)。

5、為了提升穩(wěn)定性，改善溫敏；提高使用效價，降低投料比；精純抗原，避免引入雜質(zhì)；開發(fā)性能更優(yōu)的tshr成為必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了促甲狀腺激素受體的突變體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的突變體提高了蛋白的穩(wěn)定性，改善了溫敏性，同時提高了梯度和效價等功能，且不改變與酶標(biāo)抗體及自身抗體結(jié)合的能力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了促甲狀腺激素受體的突變體，將所述促甲狀腺激素受體野生型氨基酸的第321位～第360位氨基酸中的一個或多個刪除。

4、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體，將所述促甲狀腺激素受體野生型氨基酸的第321位～第360位氨基酸刪除。

5、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體具有：

6、(1)、如seq?id?no:1所示的氨基酸序列；或

7、(2)、如(1)所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基獲得的氨基酸序列，且與(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

8、(3)、與(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

9、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體的序列如seq?id?no:1所示：

10、

11、

12、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體中所述促甲狀腺激素受體野生型氨基酸序列如seq?id?no:3所示：

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體的n端或c端還包括標(biāo)簽蛋白；所述標(biāo)簽蛋白包括：his、gst、mbp、strep、flag或fc中的一種或多種。

14、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述突變體中的所述標(biāo)簽蛋白為：flag。

15、本發(fā)明還提供了編碼上述突變體的核酸分子。

16、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述核酸分子具有：

17、(4)、如seq?id?no:2所示的核苷酸序列；或

18、(5)、如(4)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

19、(6)、與(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

20、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述核酸分子的序列如seq?id?no:2所示：

21、

22、本發(fā)明還提供了重組載體，包括：上述核酸分子以及可接受的基因元件。

23、本發(fā)明還提供了宿主，轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染上述重組載體。

24、本發(fā)明還提供了上述突變體的制備方法，獲得上述宿主、培養(yǎng)、粗純、復(fù)溶、精純、平衡、解離后，獲得所述突變體。

25、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述制備方法中，所述復(fù)溶包括膜蛋白去垢的步驟；所述膜蛋白去垢采用去污劑；所述去污劑包括：十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、n-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷、十二烷基β-d-麥芽糖苷、tritonx-100、tritonx-114、吐溫-20、chaps和chapso中的一種或多種。

26、本發(fā)明還提供了上述突變體、上述核酸分子、上述重組載體、上述宿主和/或上述制備方法獲得的突變體在如下任意項(xiàng)中的應(yīng)用；

27、(i)、制備檢測分析物tshr自身抗體的產(chǎn)品；和/或

28、(ii)、檢測分析物tshr自身抗體；和/或

29、(iii)、制備檢測tshr單克隆抗體或患者trab的產(chǎn)品；和/或

30、(iv)、制備吸收循環(huán)中的患者trab的藥物；和/或

31、(v)、制備篩選小分子片段以鑒別新的小分子的藥物骨架。。

32、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體29(突變體mut-29)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將443位的h突變?yōu)閚。

33、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體11(突變體mut-11)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將59位的l突變?yōu)閒。

34、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體18(突變體mut-18)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將151位的d突變?yōu)閑。

35、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體25(突變體mut-25)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將253位的i突變?yōu)閞。

36、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體32(突變體mut-32)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將463位的m突變?yōu)関。

37、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變體38(突變體mut-38)的氨基酸序列是在野生型如seq?id?no:3序列的基礎(chǔ)上將595位的v突變?yōu)閕。

38、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，檢測tshr抗體的方法：使用競爭法，在人血清中，trab與tshr抗體競爭抗原tshr是測量和判斷graves'病及其它甲狀腺疾病的最重要方法，本發(fā)明也是采用改方法。

39、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，改良tshr穩(wěn)定性的策略：已往專利是在1-260個氨基酸片段，采用1個或多個氨基酸突變，本發(fā)明是在全蛋白基礎(chǔ)上，在316-366之間刪去一個或多個或整個氨基酸片段，并采用標(biāo)簽純化，得到高純度高穩(wěn)定的膜蛋白。沒有改變蛋白與抗體結(jié)合等性能，不影響對graves′病及其它甲狀腺疾病判斷和測量。

40、本發(fā)明提供了促甲狀腺激素受體的突變體，將所述促甲狀腺激素受體野生型氨基酸的第321位～第360位氨基酸中的一個或多個刪除。

41、本發(fā)明采用合適的純化標(biāo)簽和一個或多個突變體，純化出新的tshr效價高、梯度高、溫敏性好。更符合試劑盒性能需求。