本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及高產(chǎn)β-石竹烯的重組解脂耶氏酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、β-石竹烯(β-caryophyllene,β-cap)主要存在于丁香葉油、丁香莖油和肉桂葉油等天然植物油中，是一種主要存在于植物中的雙環(huán)倍半萜類化合物，可用于合成香料原料如乙?；裣┑然衔?。依據(jù)我國(guó)gb?2670-1996標(biāo)準(zhǔn)，β-石竹烯被批準(zhǔn)為可使用的食用香料，尤其在辛香型日化、食用香精以及煙用香精的調(diào)配中，具有顯著的增香效果，能夠有效協(xié)調(diào)香氣并增強(qiáng)焦甜氣味。此外，在制藥行業(yè)，β-石竹烯因其抗菌、抗炎和抗抑郁等多種生物功能，被用于開發(fā)抗炎藥、止痛藥和抗癌藥物。此外，β-石竹烯還顯示出作為潛在新能源燃料的巨大潛力，尤其在航空燃料領(lǐng)域備受關(guān)注。

2、傳統(tǒng)上，β-石竹烯主要通過從植物中直接提取獲得，但這種方法面臨種植占地面積大、植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)以及易受病蟲害和氣候條件影響等問題。相較而言，微生物發(fā)酵法生長(zhǎng)周期短且可全天候生產(chǎn)，因此利用微生物來發(fā)酵生產(chǎn)β-石竹烯是一種經(jīng)濟(jì)高效的方式。現(xiàn)有技術(shù)中，需進(jìn)一步通過合成生物學(xué)改造微生物提高異源合成β-石竹烯的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供高產(chǎn)β-石竹烯的重組解脂耶氏酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了高產(chǎn)β-石竹烯的重組解脂耶氏酵母菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、高產(chǎn)β-石竹烯的重組解脂耶氏酵母菌，所述的重組解脂耶氏酵母菌表達(dá)了異源基因；所述的異源基因?yàn)辄S花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶(aacps，genbankno.agr40502.1)或其e353d突變體的編碼基因；所述β-石竹烯合成酶或其e353d突變體的編碼基因是經(jīng)密碼子優(yōu)化后所得。

4、其中，所述的黃花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述的黃花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶e353d突變體的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、其中，所述的重組解脂耶氏酵母菌表達(dá)了1-3個(gè)拷貝數(shù)的異源基因；優(yōu)選地，所述的重組解脂耶氏酵母菌表達(dá)了2個(gè)拷貝數(shù)的黃花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶e353d突變體的編碼基因。

6、其中，所述的重組解脂耶氏酵母菌同時(shí)表達(dá)了3-羥基-3-甲基戊二酰coa還原酶編碼基因thmg1、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶編碼基因idi和法尼基焦磷酸合酶編碼基因erg20中的任意一種或多種的組合。其中，所述的thmg1的genbank登錄號(hào)為xp_503558.1，所述的idi的genbank登錄號(hào)為yali0f04015g，所述的erg20的genbank登錄號(hào)為yali0e05753g。詳細(xì)信息均見中國(guó)專利cn116656518a。

7、所述的重組解脂耶氏酵母菌同時(shí)將脂肪酶編碼基因tgl4的內(nèi)源啟動(dòng)子ptgl4替換為pyat1；所述的pyat1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。利用解脂耶氏酵母內(nèi)源的脂質(zhì)時(shí)期激活的氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子pyat1替換內(nèi)源脂肪酶編碼基因(tgl4)的天然啟動(dòng)子(ptgl4，atg前端500bp)。ptgl4的核苷酸序列和seq?id?no.4所示。

8、優(yōu)選地，所述重組解脂耶氏酵母還表達(dá)1個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因；所述標(biāo)記基因選自3(β)-異丙基蘋果酸脫氫酶編碼基因表達(dá)盒或乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶編碼基因表達(dá)盒。

9、優(yōu)選地，所述重組解脂耶氏酵母菌敲除了ku70基因。所述重組解脂耶氏酵母菌的出發(fā)菌為敲除了ku70基因的解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)po1f，其中po1f購于美國(guó)菌種保藏中心，編號(hào)為atcc?mya-2613。

10、優(yōu)選地，所述的重組解脂耶氏酵母菌表達(dá)了2個(gè)拷貝數(shù)的黃花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶e353d突變體的編碼基因，同時(shí)表達(dá)了thmg1、idi和erg20，并將tgl4的內(nèi)源啟動(dòng)子ptgl4替換為pyat1；

11、其中，所述的黃花蒿artemisia?annua來源的β-石竹烯合成酶e353d突變體編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述的thmg1的genbank登錄號(hào)為xp_503558.1，所述idi的genbank登錄號(hào)為yali0f04015g，所述erg20的genbank登錄號(hào)為yali0e05753g，所述的pyat1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

12、第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述重組解脂耶氏酵母菌的構(gòu)建方法，將所述的β-石竹烯合成酶或其e353d突變體的編碼基因以基因表達(dá)盒的形式整合在酵母基因組上。具體包括如下步驟：

13、(1)構(gòu)建異源基因表達(dá)盒：擴(kuò)增啟動(dòng)子、異源基因和終止子，分別得到啟動(dòng)子基因片段、異源基因片段和終止子基因片段，同時(shí)連接至質(zhì)粒載體中，得到含有異源基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體；優(yōu)選地，所述的整合在解脂耶氏酵母基因組上，整合位點(diǎn)為解脂耶氏酵母的a08位點(diǎn)、26s?rdna位點(diǎn)、inta位點(diǎn)、intb位點(diǎn)、intc位點(diǎn)、intd位點(diǎn)、inte位點(diǎn)、intf位點(diǎn)、lip1位點(diǎn)、scp2位點(diǎn)，或ylscd位點(diǎn)中的任意一種或多種。所述啟動(dòng)子為解脂耶氏酵母的啟動(dòng)子ptef、php4d、ptefin、pfba、pfbain、ppox2、ppot1或pgpd中的任意一種；所述終止子為解脂耶氏酵母的終止子txpr2t、tmig1t、tlip2t、tcyc1t、tpex3t、tpex10t或tpex20t中的任意一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的整合位點(diǎn)為解脂耶氏酵母的a08位點(diǎn)和intb位點(diǎn)，所述啟動(dòng)子為解脂耶氏酵母的啟動(dòng)子ptefin，所述終止子為解脂耶氏酵母的終止子txpr2t。

14、(2)將所述的含有異源基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入解脂耶氏酵母中，使基因表達(dá)盒整合在解脂耶氏酵母基因組上；

15、優(yōu)選地，所述的構(gòu)建方法包括步驟(3)，所述的步驟(3)為，構(gòu)建thmg1表達(dá)盒、idi表達(dá)盒、erg20表達(dá)盒和啟動(dòng)子替換表達(dá)盒中的任意一種或幾種，并整合在步驟(2)構(gòu)建得到的解脂耶氏酵母的基因組上。所述thmg1表達(dá)盒、idi表達(dá)盒和erg20表達(dá)盒的構(gòu)建過程和詳細(xì)信息均見中國(guó)專利cn116656518a。

16、其中，步驟(3)中，所述的啟動(dòng)子替換表達(dá)盒，包含脂肪酶基因tgl4啟動(dòng)子上游同源臂、啟動(dòng)子pyat1和脂肪酶編碼基因tgl4起始密碼子下游同源臂。優(yōu)選地，所述的脂肪酶編碼基因tgl4啟動(dòng)子為tgl4基因起始密碼子前500bp。

17、步驟(1)-(3)構(gòu)建得到的重組解脂耶氏酵母菌命名為xj-cap株。

18、第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述重組解脂耶氏酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)β-石竹烯中的應(yīng)用。

19、優(yōu)選地，所述的發(fā)酵包括如下步驟：(1)采用不添加有機(jī)溶劑的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)第一方面所述的重組解脂耶氏酵母菌，得到發(fā)酵產(chǎn)物；(2)離心收集上層液體，添加有機(jī)相，離心即得到富含β-石竹烯的有機(jī)相，所述有機(jī)相優(yōu)選為正十二烷。

20、有益效果：

21、本發(fā)明構(gòu)建的重組解脂耶氏酵母菌yarrowia?lipolytica?xj-cap株，是基于敲除了負(fù)責(zé)編碼非同源重組基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重組能力增強(qiáng)，通過解脂耶氏酵母自身的同源重組功能實(shí)現(xiàn)基因的整合，能大幅度提高導(dǎo)入基因的遺傳穩(wěn)定性。該重組解脂耶氏酵母構(gòu)建方法高效，操作簡(jiǎn)單。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的重組解脂耶氏酵母yarrowia?lipolytica?xj-cap株過表達(dá)了2個(gè)拷貝的β-石竹烯合成酶e353d突變體編碼基因、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶編碼基因、法尼基焦磷酸合酶編碼基因，以及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶編碼基因，同時(shí)利用解脂耶氏酵母內(nèi)源的脂質(zhì)時(shí)期激活的氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子pyat1替換內(nèi)源脂肪酶4編碼基因的天然啟動(dòng)子，實(shí)驗(yàn)證明該重組解脂耶氏酵母經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵后能夠生產(chǎn)6.27g/l的β-石竹烯，實(shí)現(xiàn)了植物來源天然產(chǎn)物β-石竹烯在解脂耶氏酵母中的高效合成。