本發(fā)明涉及微生物，尤其涉及一種微需氧菌的培養(yǎng)方法及其在藥敏測試中的應用。

背景技術：

1、微需氧細菌是一類在氧氣濃度低于大氣中正常氧氣水平(約21％)的條件下生長更好的細菌。它們需要的氧氣濃度通常在2％至10％之間，過多的氧氣對其有毒害作用。這類細菌通常生活在低氧環(huán)境中，如深層土壤、水體底層、動物腸道等。常見的微需氧菌有彎曲菌屬、螺桿菌屬、假單胞菌屬等。微需氧細菌與人類的健康有著密切的關系。人體腸道屬于微氧環(huán)境，大量腸道益生菌、病原菌只能在微需氧條件下才能生長。如幽門螺桿菌和空腸彎曲菌均為微需氧菌，對于這類菌的研究需要嚴苛的培養(yǎng)條件，一般是是5％?o2、10％?co2、85％?n2的微氧環(huán)境。

2、對于微需氧菌，目前一般是采用固體平板的培養(yǎng)方式，將細菌接種至固體培養(yǎng)基表面后置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式存在以下問題：一是固體培養(yǎng)基表面積有限；二是固體培養(yǎng)基上的營養(yǎng)物質擴散效果差，細菌在消耗完周邊的營養(yǎng)成分后無法繼續(xù)生長；此外，固體平板培養(yǎng)的操作較為繁瑣，耗時長。因此，固體平板培養(yǎng)難以收集大量微需氧菌。也有部分研究報道使用液體培養(yǎng)的方法培養(yǎng)微需氧菌，但實踐操作中，液體培養(yǎng)微需氧菌存在穩(wěn)定性差的問題，主要原因是液體中的溶解氧含量受到空氣中氧濃度、液體攪動頻率和速度、液體粘度等多種因素影響，研究人員只能控制培養(yǎng)環(huán)境中空氣里面的氧氣濃度，無法準確控制液體中溶解氧的含量。溶解氧過低和過高均會導致微需氧細菌培養(yǎng)失敗。因此，需要開發(fā)更高效的微需氧菌培養(yǎng)方法。

3、抗生素是治療細菌感染的最重要藥物。近年來，耐藥菌、乃至超級細菌不斷出現(xiàn)，臨床治療亟待新的抗生素，也推動了新抗生素的篩選和成藥研究。常規(guī)的抗菌活性測試(又稱藥敏測試)一般采用濾紙片擴散法或液體培養(yǎng)法。濾紙片擴散法是將藥物滴加在濾紙片上，貼在接種有細菌的固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)一段時間后，通過測量濾紙片周邊透明圈大小(代表此處沒有細菌生長)來確認是否具有抗菌活性。濾紙片法的不足之處在于，很難控制從紙片中擴散到培養(yǎng)基里面的藥物的真實濃度，無法給出明確的劑量-效應關系。液體培養(yǎng)是向液體中加入不同濃度的藥物，定量測定細菌的生長情況，進而可以給出明確的劑量-效應關系。該法適用于常規(guī)的好氧細菌和厭氧細菌，但因微需氧菌在液體培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，也不適宜幽門螺桿菌等微需氧菌的抗菌測試。因此，需要開發(fā)新的微需氧菌抗菌測試方法。

技術實現(xiàn)思路

1、針對以上技術問題，本發(fā)明公開了一種微需氧菌的培養(yǎng)方法及其在藥敏測試中的應用，操作簡單，成本低廉，培養(yǎng)效果好。

2、對此，本發(fā)明采用的技術方案為：

3、一種微需氧菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

4、步驟s1，選擇合適大小的多孔海綿材料，高溫滅菌后，置于培養(yǎng)器皿內；所述多孔海綿材料為竹纖維、棉纖維或聚氨酯；

5、步驟s2，配置液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，接種待培養(yǎng)的微需氧菌種，充分混勻成懸浮液，得到含有菌種的液體培養(yǎng)基；

6、步驟s3，將含有菌種的液體培養(yǎng)基滴加到培養(yǎng)器皿內的多孔海綿類材料上；將培養(yǎng)器皿置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12-72小時。

7、采用此技術方案，將液體培養(yǎng)基中加入多孔海綿結構類材料，其在液體內形成支架，表面張力使得多孔海綿類材料的表面形成一層液體薄膜，更有利于菌種的培養(yǎng)，而且培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于單純的液體培養(yǎng)法。

8、作為本發(fā)明的進一步改進，所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法還包括步驟s4，待細菌生長到足夠量后，擠壓海綿，使用無菌的培養(yǎng)基或水溶液沖洗海綿，收集液體，即可獲得需要的微需氧菌。

9、作為本發(fā)明的進一步改進，所述多孔海綿材料的密度為18-55g/m3。進一步地，所述多孔海綿材料的密度為18-45g/m3；進一步優(yōu)選地，所述多孔海綿材料的密度為30-45g/m3。

10、作為本發(fā)明的進一步改進，所述多孔海綿材料為聚氨酯海綿。

11、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s3中，所述培養(yǎng)箱的環(huán)境為5％?o2、10％?co2、85％n2的三氣環(huán)境。

12、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s2中，所述液體培養(yǎng)基包括bhi肉湯培養(yǎng)基。

13、本發(fā)明還公開了如上所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法在藥敏測試中的應用。

14、作為本發(fā)明的進一步改進，所述應用包括：待步驟s3培養(yǎng)結束后，向培養(yǎng)器皿內加入mtt溶液，擠壓多孔海綿材料混勻液體后，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h；

15、然后向培養(yǎng)器皿內加入無水乙醇，溶解mtt代謝后形成的藍紫色結晶物甲瓚；

16、取培養(yǎng)器皿的溶液至比色皿或酶標板內，使用分光光度計或酶標儀測定570nm處的吸光度。

17、進一步地，無水乙醇的加入體積為培養(yǎng)器皿內液體體積的2-4倍。

18、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

19、采用本發(fā)明的技術方案，選擇合適的多孔材料置于液體培養(yǎng)基中，形成一個支架結構，液體通過表面張力在多孔材料表面形成薄膜，進而形成穩(wěn)定的微需氧液體環(huán)境，該液體中模擬微需氧菌在生物體內的環(huán)境，微需氧菌的生長速度更快，收獲細菌總量更多。進一步地的，可以根據(jù)需要在該體系中加入不同濃度的藥物，后續(xù)使用mtt法測定細菌活力進而對細菌總量進行測定，即可進行抗菌活性測試。本方法所得結果穩(wěn)定，可重復性高，操作簡單，可批量化進行實驗，對藥物的敏感度高，且能給出明確的劑量-效應關系，可以廣泛應用于微需氧菌的培養(yǎng)和藥敏測試。

技術特征：

1.一種微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：包括如下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：還包括步驟s4，待細菌生長到足夠量后，擠壓海綿，使用無菌的培養(yǎng)基或水溶液沖洗海綿，收集液體，即可獲得需要的微需氧菌。

3.根據(jù)權利要求1所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述多孔海綿材料的密度為18-55g/m3。

4.根據(jù)權利要求3所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述多孔海綿材料的密度為30-45g/m3。

5.根據(jù)權利要求4所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述多孔海綿材料為聚氨酯海綿。

6.根據(jù)權利要求1所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s3中，所述培養(yǎng)箱的環(huán)境為5％o2、10％co2、85％n2的三氣環(huán)境。

7.根據(jù)權利要求1所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s2中，所述液體培養(yǎng)基包括bhi肉湯培養(yǎng)基。

8.如權利要求1～7任意一項所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法在藥敏測試中的應用。

9.根據(jù)權利要求8所述的微需氧菌的培養(yǎng)方法在藥敏測試中的應用，其特征在于：待步驟s3培養(yǎng)結束后，向培養(yǎng)器皿內加入mtt溶液，擠壓多孔海綿材料混勻液體后37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h；

技術總結
本發(fā)明提供了一種微需氧菌的培養(yǎng)方法及其在藥敏測試中的應用，該培養(yǎng)方法包括如下步驟：步驟S1，選擇合適大小的多孔海綿材料，高溫滅菌后，置于培養(yǎng)器皿內；所述多孔海綿材料為竹纖維、棉纖維或聚氨酯；步驟S2，配置液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，接種待培養(yǎng)的微需氧菌種，充分混勻成懸浮液，得到含有菌種的液體培養(yǎng)基；步驟S3，將含有菌種的液體培養(yǎng)基滴加到培養(yǎng)器皿內的多孔海綿類材料上；將培養(yǎng)器皿置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12?72小時。采用本發(fā)明的技術方案，結果穩(wěn)定，可重復性高，操作簡單，可批量化進行實驗，具有更好的培養(yǎng)效果。

技術研發(fā)人員：李思思,盧梅,謝澤仁,張根,何子楹,劉少韻,陸嘉惠,曾憲金,石振宇
受保護的技術使用者：維塔探索（廣東）科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9