本發(fā)明屬于納米，具體涉及一種檢測(cè)白血病患者dna結(jié)構(gòu)變異區(qū)域的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生與多種基因突變有關(guān)。有些基因原本是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)基因發(fā)生改變，直接影響了下游信號(hào)傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡受阻、分化障礙等，導(dǎo)致白血病的發(fā)生。通過基因檢測(cè)，可以檢測(cè)到白血病患者體內(nèi)的基因突變情況，從而幫助醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷病情、制定治療方案和預(yù)測(cè)預(yù)后。幫助白血病患者和家屬更好地了解病情和治療方案，患者和家屬可以通過基因檢測(cè)結(jié)果了解患者的基因突變情況，以及這些突變對(duì)治療方案和預(yù)后的影響。這有助于患者和家屬更好地參與治療決策和疾病管理。

2、變異是導(dǎo)致基因組差異的最重要因素，具體可分為單個(gè)堿基對(duì)的變異(snvs/snps)、小的插入或缺失(indels≤50bp)以及結(jié)構(gòu)變異(structure?variation，svs>50bp)。根據(jù)結(jié)構(gòu)變異的不同類型，結(jié)構(gòu)變異可以進(jìn)一步分為dna序列的插入、缺失、重復(fù)、倒位、易位、拷貝數(shù)變異等。結(jié)構(gòu)變異可以影響基因組的穩(wěn)定性、相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而決定物種表型。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)人類基因組都有超過20000個(gè)結(jié)構(gòu)變異，基因組結(jié)構(gòu)變異可能導(dǎo)致的疾病已經(jīng)超過1000種，例如漸凍癥、精神分裂癥以及癌癥。結(jié)構(gòu)變異帶來的影響比snvs/snps或者是indels帶來的影響更大。多個(gè)研究表明，結(jié)構(gòu)變異能夠更好的解析群體結(jié)構(gòu)，為我們更深入了解動(dòng)植物馴化過程提供進(jìn)一步的有效信息。

3、現(xiàn)有技術(shù)中分析結(jié)構(gòu)變異常用細(xì)胞遺傳學(xué)方法，例如核型分析或熒光原位雜交(fish)，但是這些方法在檢測(cè)中等到小序列級(jí)別的結(jié)構(gòu)變異時(shí)具有相對(duì)較低的靈敏性和分辨率的缺點(diǎn)，而且操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。21世紀(jì)以來，隨著微陣列、細(xì)菌人工染色體等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，人們開始使用陣列比較基因組雜交(acgh)等方法來檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異。這種方法具有改進(jìn)的分辨率、通量和敏感性，但是依然是費(fèi)力的、成本較高。

4、當(dāng)前的二代測(cè)序方法，尤其是全基因組測(cè)序，被廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異。雖然精度高，但是讀長(zhǎng)短，不能跨越大多數(shù)長(zhǎng)度較長(zhǎng)的sv區(qū)域，只能是基于序列組裝的方法來檢測(cè)，無法提供足夠的信息。雖然單分子測(cè)序的三代測(cè)序技術(shù)(如pacbio，nanopore測(cè)序)可以測(cè)得長(zhǎng)達(dá)100kp的序列，但是其錯(cuò)誤率較高(約15％)、成本高、操作同樣復(fù)雜。

5、因此，需要一種靈敏度高，覆蓋面廣的檢測(cè)方法來檢測(cè)白血病患者的基因突變情況，正對(duì)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)對(duì)治療方案和預(yù)后進(jìn)行調(diào)整。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)白血病患者dna基因組結(jié)構(gòu)變異分析的方法，本發(fā)明提供的方法不僅操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、分辨率高、特異性好、效率高、穩(wěn)定性好且能覆蓋中等到小序列級(jí)別的結(jié)構(gòu)變異。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種檢測(cè)白血病患者dna結(jié)構(gòu)變異區(qū)域的方法，包括以下步驟：

4、(1)提取白血病患者的dna的多個(gè)核酸分子；

5、(2)將步驟(1)中dna的多個(gè)核酸分子與帶有第一標(biāo)記物的肽核酸分子混合，得到標(biāo)記產(chǎn)物；

6、(3)將步驟(2)中的標(biāo)記產(chǎn)物和第二標(biāo)記物混合，進(jìn)行雜交反應(yīng)，反產(chǎn)物加入磁珠結(jié)合、洗滌，溶于洗脫液中，得到標(biāo)記好的dna的多個(gè)核酸分子；

7、(4)將步驟(3)中標(biāo)記好的dna的多個(gè)核酸分子經(jīng)過納米通道使分子線性，檢測(cè)dna骨架和特異序列上的兩個(gè)標(biāo)記物熒光信號(hào)進(jìn)行光學(xué)成像，并與參比基因組對(duì)比分析得出dna的結(jié)構(gòu)變異結(jié)果。

8、步驟(1)中所述第一標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物；

9、步驟(3)中所述第二標(biāo)記物是非特異性熒光標(biāo)記物。

10、優(yōu)選地，所述參比基因組是健康人群dna基因組，屬于完全完整的基因組序列，且與白血病患者dna分子進(jìn)行相同處理和標(biāo)記的序列和位置信息。

11、優(yōu)選地，上述方法中步驟(3)所述雜交反應(yīng)過程包括步驟(2)中所述標(biāo)記產(chǎn)物和第二標(biāo)記物的混合物雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，所述雜交液包括150mm?nacl，15mm檸檬酸鈉和0.02％tween-20，雜交條件為ph?7.0，30℃下反應(yīng)1h。

12、優(yōu)選地，洗脫液選自low?te緩沖液(10mm?tris-hcl,0.1mm?edta)或無核酸酶水。

13、優(yōu)選地，上述方法步驟(4)中還包括將所述標(biāo)記好的dna的多個(gè)核酸分子的光學(xué)成像進(jìn)行組裝以構(gòu)建所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子的基因組區(qū)域的第一種圖譜；將所述基因組區(qū)域的第一種圖譜與參比基因組的第二種圖譜進(jìn)行比較，以確定所述第一種圖譜與所述第二種圖譜之間的相似性和差異性，進(jìn)而確定白血病患者dna的結(jié)構(gòu)變異的區(qū)域；所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子覆蓋所述檢測(cè)基因組區(qū)域的完整長(zhǎng)度或者部分長(zhǎng)度。

14、優(yōu)選地，所述肽核酸序列在所述基因組區(qū)域中具有至少1個(gè)位點(diǎn)/100kb的平均重復(fù)頻率，優(yōu)選為5-35個(gè)位點(diǎn)/100kb的平均重復(fù)頻率，更優(yōu)選為12-17個(gè)位點(diǎn)/100kb的平均重復(fù)頻率。

15、更優(yōu)選地，所述第二種圖譜是從參比基因中生成。

16、優(yōu)選地，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子具有至少150kb的長(zhǎng)度，上述步驟(4)線性化步驟包括將核酸分子拉伸至其總長(zhǎng)度的70％-100％。

17、優(yōu)選地，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子要與和所述肽核酸分子接觸。

18、優(yōu)選地，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子要與所述第二種標(biāo)記物的分子接觸。

19、本發(fā)明還包括上述檢測(cè)方法在血液腫瘤疾病診斷、預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)治療中的應(yīng)用

20、本發(fā)明的有益效果：

21、1、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短：本發(fā)明的標(biāo)記過程只需要1個(gè)小時(shí)，比現(xiàn)有的酶法孵育的標(biāo)記方法省了4-5個(gè)小時(shí)。

22、2、分辨率高、特異性好：目前成熟的核型分析能夠染色的條帶也僅有500個(gè)左右，因此只能在5mbp的分辨率范圍觀察，而本方法全基因組范圍內(nèi)擁有500000個(gè)左右的標(biāo)記信號(hào)，分辨率約500bp，分辨率是核型分析的10000倍。本方法使用的肽核酸只對(duì)基因組特異序列進(jìn)行雜交互補(bǔ)，不需要經(jīng)過酶結(jié)構(gòu)域的識(shí)別，特異性好。

23、3、效率高且穩(wěn)定性好：熒光標(biāo)記物直接修飾在肽核酸分子上，而肽核酸直接雜交互補(bǔ)基因組特定序列，沒有中間酶識(shí)別環(huán)節(jié)，也無需識(shí)別特定序列上的特定堿基，相同作用時(shí)間下，效率更高，成功率更高。而且肽核酸分子不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解，與dna之間的親和力也較dna/dna雜交鏈更為穩(wěn)定，又能以hoogsteen鍵形成非常穩(wěn)定的pna2/dna三鏈結(jié)構(gòu)。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)白血病患者dna結(jié)構(gòu)變異區(qū)域的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述參比基因是健康人群dna基因組，屬于完全完整的基因組序列，且與白血病患者dna分子進(jìn)行相同處理和標(biāo)記的序列和位置信息。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中所述雜交反應(yīng)過程包括步驟(2)中所述標(biāo)記產(chǎn)物和第二標(biāo)記物的混合物在雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，所述雜交液包括150mmnacl，15mm檸檬酸鈉和0.02％tween-20；所述第二標(biāo)記物選自eb、sybr?green?i、sybrgold、sybr?safe、gelstar、pi、dapi、hoechst和draq5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述步驟(4)還包括將所述標(biāo)記好的dna的多個(gè)核酸分子的光學(xué)成像進(jìn)行組裝以構(gòu)建所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子的基因組區(qū)域的第一種圖譜；將所述基因組區(qū)域的第一種圖譜與參比基因組的第二種圖譜進(jìn)行比較，以確定所述第一種圖譜與所述第二種圖譜之間的相似性和差異性，進(jìn)而確定白血病患者dna的結(jié)構(gòu)變異的區(qū)域；所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子覆蓋所述檢測(cè)基因組區(qū)域的完整長(zhǎng)度或者部分長(zhǎng)度。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述肽核酸序列在所述基因組區(qū)域中具有5-35個(gè)位點(diǎn)/100kb的平均重復(fù)頻率。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述第二種圖譜是從參比基因中生成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子具有至少150kb的長(zhǎng)度，其中所述權(quán)利要求1中步驟(4)線性化步驟包括將標(biāo)記好的dna的多個(gè)核酸分子拉伸至其總長(zhǎng)度的70％-100％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子要與所述肽核酸分子接觸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述白血病患者dna的多個(gè)核酸分子要與所述第二種標(biāo)記物的分子接觸。

10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法在血液腫瘤疾病診斷、預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)治療中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)白血病患者DNA基因組結(jié)構(gòu)變異的方法，變異包括插入、缺失、融合和重復(fù)等。通過對(duì)白血病患者DNA基因組上的特定序列用結(jié)合熒光的肽核酸分子互補(bǔ)雜交進(jìn)而標(biāo)記上標(biāo)記物，再用非特異性熒光標(biāo)記物對(duì)整個(gè)DNA基因組染色，標(biāo)記后的DNA的多個(gè)核酸分子經(jīng)過納米通道拉伸后，可用于分析特定序列的熒光，進(jìn)而可以確定特定序列之間的位置信息，與參比基因組的特定序列的位置信息經(jīng)過對(duì)比分析后，就可以分析白血病患者DNA基因組上的結(jié)構(gòu)變異。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、分辨率高、特異性好、效率高且穩(wěn)定性好。

技術(shù)研發(fā)人員：謝珍,張鵬,邢寬,曾志鵬,余同,何貴倫
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京實(shí)踐醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6