本發(fā)明涉及一種聚磷酸激酶突變體、表達(dá)該突變體的重組基因工程菌及其應(yīng)用，屬于酶。

背景技術(shù)：

1、甘露糖被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物科技等領(lǐng)域，傳統(tǒng)方法生產(chǎn)d-甘露糖一般采用植物組織水解法，或者是以d-葡萄糖為原料進(jìn)行化學(xué)合成，化學(xué)合成法需要使用化學(xué)催化劑，且需要在嚴(yán)格控制溫度和酸濃度的條件下進(jìn)行生產(chǎn)。

2、但是化學(xué)法合成d-甘露糖存在能耗大，生產(chǎn)成本高，反應(yīng)條件苛刻，生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)形成副產(chǎn)物，后續(xù)純化操作復(fù)雜等問(wèn)題。

3、近年來(lái)有許多學(xué)者開始研究用生物轉(zhuǎn)化的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)甘露糖的綠色生產(chǎn)，生物轉(zhuǎn)化方法是采用酶進(jìn)行催化反應(yīng)?，F(xiàn)有技術(shù)中以葡萄糖為原料多酶催化制備甘露糖，具體過(guò)程為葡萄糖在聚磷酸激酶（簡(jiǎn)稱為ppgk酶）催化作用下生成葡萄糖6-磷酸，然后在葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱為pgi酶）催化作用下生成果糖6-磷酸，在甘露糖6-磷酸異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱為m6pi酶）的催化作用下生成甘露糖6-磷酸，最后在甘露糖6-磷酸磷酸酶（簡(jiǎn)稱為m6pp酶）的催化作用下生成甘露糖，其中pgi酶、m6pi酶可以使用雙功能酶葡萄糖磷酸異構(gòu)酶/甘露糖6-磷酸異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱為pgi/m6pi酶）代替。

4、現(xiàn)有的野生型ppgk酶在用于甘露糖的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)時(shí)，存在酶活低，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率較低的問(wèn)題；野生型ppgk酶的基因構(gòu)建的重組基因工程菌，對(duì)ppgk酶的表達(dá)量也較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種聚磷酸激酶突變體、表達(dá)該突變體的重組基因工程菌及其應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)以下發(fā)明目的：提高ppgk酶的酶活，提高含ppgk酶突變體基因的重組基因工程菌對(duì)ppgk酶的表達(dá)水平。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

3、一種聚磷酸激酶突變體，所述聚磷酸激酶突變體為f45s、v115d或a200d中的一種；所述f45s的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.10所示；所述v115d的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.12所示；所述a200d的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.14所示。

4、所述f45s相較于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第45位的苯丙氨酸突變成絲氨酸；所述v115d相較于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第115位的纈氨酸突變成天冬氨酸；所述a200d相較于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第200位的丙氨酸突變成天冬氨酸。

5、所述f45s的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.9所示；所述v115d的核苷酸序列如序列表中seqid?no.11所示；所述a200d的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.13所示。

6、表達(dá)所述聚磷酸激酶突變體的重組基因工程菌。

7、所述的聚磷酸激酶突變體在合成甘露糖中的應(yīng)用。

8、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得以下有益效果：

9、1、本發(fā)明在野生型ppgk酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)行定點(diǎn)突變改變ppgk酶分子結(jié)構(gòu)，獲得ppgk酶突變體，提高了ppgk酶的酶活，并構(gòu)建了含ppgk酶突變體基因的重組基因工程菌，其對(duì)ppgk酶的表達(dá)水平明顯提高。

10、2、本發(fā)明所述ppgk酶突變體，在75℃條件下，相對(duì)于野生型ppgk酶，具有139.6-160.8％的相對(duì)酶活。

11、3、本發(fā)明構(gòu)建的含ppgk酶突變體v115d基因的重組基因工程菌、含ppgk酶突變體a200d基因的重組基因工程菌，相對(duì)于含野生型ppgk酶基因的重組基因工程菌，對(duì)ppgk酶的表達(dá)水平明顯提高。

技術(shù)特征：

1.一種聚磷酸激酶突變體，其特征在于：所述聚磷酸激酶突變體為f45s、v115d或a200d中的一種；所述f45s的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.10所示；所述v115d的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.12所示；所述a200d的氨基酸序列如序列表中seq?id?no.14所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚磷酸激酶突變體，其特征在于：所述f45s的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.9所示；所述v115d的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.11所示；所述a200d的核苷酸序列如序列表中seq?id?no.13所示。

3.表達(dá)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述聚磷酸激酶突變體的重組基因工程菌。

4.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的聚磷酸激酶突變體在合成甘露糖中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種聚磷酸激酶突變體、表達(dá)該突變體的重組基因工程菌及其應(yīng)用，屬于酶技術(shù)領(lǐng)域，所述聚磷酸激酶突變體為F45S、V115D或A200D中的一種；所述F45S的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.10所示；所述V115D的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.12所示；所述A200D的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.14所示。本發(fā)明在野生型PPGK酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)行定點(diǎn)突變改變PPGK酶分子結(jié)構(gòu)，獲得PPGK酶突變體，提高了PPGK酶的酶活，并構(gòu)建了含PPGK酶突變體基因的重組基因工程菌，其對(duì)PPGK酶的表達(dá)水平明顯提高。

技術(shù)研發(fā)人員：唐春暉,趙培培,付吉明,劉敏,張治家,柴光臻,張彩云,周曉琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東天力藥業(yè)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23