本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)，涉及采用分子標(biāo)記引物及化學(xué)熒光的方法對(duì)微量或痕跡量檢材進(jìn)行檢測(cè)的方案，具體為快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、y-str(y染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列)是一種位于男性y染色體上的遺傳標(biāo)記，由2至6個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于司法取證、親子鑒定和族譜基因檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。y染色體作為男性特有的染色體，具有父系單向傳承的特點(diǎn)，使得y-str在法醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)研究中具有獨(dú)特價(jià)值。

2、目前，市場(chǎng)上y-str主流試劑盒擴(kuò)增片段大小均在550bp-600bp。雖然可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)，但無(wú)法兼顧片段長(zhǎng)度，特別是在微量、降解樣本中無(wú)法檢出350bp后的大片段，從而無(wú)法獲得完整準(zhǔn)確的基因分型，且各廠商的試劑盒擴(kuò)增位點(diǎn)片段從小到大排列順序大部分按照核心基因座<優(yōu)選基因座<備選基因座，在微量及降解樣本檢測(cè)中難以通過(guò)更換產(chǎn)品、加測(cè)反應(yīng)來(lái)增加獲取基因座數(shù)量，尤其是重大疑難案件中很難達(dá)到法醫(yī)鑒定、親緣鑒定以及家系排查等目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問(wèn)題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)公安一線對(duì)法醫(yī)dna檢測(cè)試劑的高精度、高效率和高通量的需求，提升案件偵破效率和準(zhǔn)確性；同時(shí)，結(jié)合八色熒光檢測(cè)技術(shù)，將試劑盒與檢測(cè)平臺(tái)深度整合，優(yōu)化檢測(cè)流程，提升檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。此外，為了大幅度增加350bp范圍內(nèi)的可檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，從而大幅提升對(duì)常規(guī)樣本、陳舊腐敗樣本、微量樣本、降解樣本等檢材的位點(diǎn)檢出數(shù)，從而達(dá)到法醫(yī)鑒定、親緣鑒定以及家系排查等目的。鑒于此，本發(fā)明提供了快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒及應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，所述試劑盒包括擴(kuò)增21個(gè)y-str基因座的19對(duì)特異性擴(kuò)增引物序列，其中y-str基因座為：dys392、dys389i/ii、dys447、dys391、dys456、dys19、dys437、dys481、dys533、dys390、dys393、gata_h4、dys439、dys576、dys458、dys635、dys448、dys438、dys385a/b。

3、優(yōu)選的，所述擴(kuò)增21個(gè)y-str基因座的19對(duì)特異性擴(kuò)增引物序列為：dys392、seqid?no:1～2；dys389i/ii、seq?id?no:3～5；dys447、seq?id?no:6～7；dys391、seq?id?no:8～9；dys456、seq?id?no:10～11；dys19、seq?id?no:12～13；dys437、seq?id?no:14～15；dys481、seq?id?no:16～17；dys533、seq?id?no:18～19；dys390、seq?id?no:20～21；dys393、seq?id?no:22～23；gata_h4、seq?id?no:24～25；dys439、seq?id?no:26～27；dys576、seq?id?no:28～29；dys458、seq?id?no:30～31；dys635、seq?id?no:32～33；dys448、seq?id?no:34～35；dys438、seq?id?no:36～37；dys385a/b、seq?id?no:38～39。

4、優(yōu)選的，所述19對(duì)特異性擴(kuò)增引物的濃度為：dys392、0.24μm；dys389i/ii、0.22μm；dys447、0.14μm；dys391、0.19μm；dys456、0.21μm；dys19、0.34μm；dys437、0.18μm；dys481、0.14μm；dys533、0.33μm；dys390、0.27μm；dys393、0.45μm；gata_h4、0.37μm；dys439、0.14μm；dys576、0.23μm；dys458、0.24μm；dys635、0.19μm；dys448、0.12μm；dys438、0.25μm；dys385a/b、0.27μm。

5、所述試劑盒中的引物及其序列和濃度如下表所示：

6、表1本發(fā)明所述試劑盒特異性擴(kuò)增引物信息

7、

8、

9、優(yōu)選的，所述基因座及其19對(duì)特異性擴(kuò)增引物分為7組，具體為：dys392、dys389i/ii、dys447為第一組；dys391、dys456、dys19為第二組；dys437、dys481、dys533、dys390為第三組；dys393、gata_h4、dys439為第四組；dys576、dys458為第五組；dys635、dys448為第六組；dys438、dys385a/b為第七組。

10、優(yōu)選的，采用熒光染料標(biāo)記7組特異性擴(kuò)增引物，且對(duì)每對(duì)引物中至少一條引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記；其中熒光染料為6-fam、hex、t13、sum、lyn、pur或h13，且每組采用的熒光標(biāo)記不同，內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光siz。

11、優(yōu)選的，各組引物采用的熒光染料為：第一組6-fam、第二組hex、第三組t13、第四組sum、第五組lyn、第六組pur、第七組h13。

12、優(yōu)選的，所述試劑盒包括：pcr反應(yīng)混合液、sdh2o、基因分型標(biāo)準(zhǔn)物allelicladder和熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)；其中，pcr反應(yīng)混合液的組成為：mgcl28.0mm，tris-hcl?145mm，kcl135mm，dntps?8.5mm，bsa?4g/l，熱啟動(dòng)taq酶2u/μl。

13、優(yōu)選的，所述試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性10秒，60℃退火60秒，68℃延伸60秒，29個(gè)循環(huán)；60℃終延伸15分鐘；4℃保溫。

14、以上任一所述快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒在法醫(yī)鑒定、親緣鑒定及家系排查分析中的應(yīng)用。

15、優(yōu)選的，所述法醫(yī)鑒定、親緣鑒定及家系排查針對(duì)的樣本包括：常規(guī)樣本、陳舊腐敗樣本、微量樣本和降解樣本。

16、有益效果：(1)本發(fā)明所述試劑盒結(jié)合八色熒光檢測(cè)技術(shù)，將試劑盒與檢測(cè)平臺(tái)深度整合，優(yōu)化檢測(cè)流程，提升檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性；(2)所述試劑盒大幅增加了350bp范圍內(nèi)的可檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，從而大幅提升對(duì)常規(guī)樣本、陳舊腐敗樣本、微量樣本、降解樣本等檢材的位點(diǎn)檢出數(shù)，從而達(dá)到法醫(yī)鑒定、親緣鑒定以及家系排查等目的；(3)在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用過(guò)程中，因試劑盒具有高精度、高效率和高通量的優(yōu)勢(shì)，因此大大提高了公安一線案件偵破效率和準(zhǔn)確性。

技術(shù)特征：

1.快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括擴(kuò)增21個(gè)y-str基因座的19對(duì)特異性擴(kuò)增引物序列，其中y-str基因座為：dys392、dys389i/ii、dys447、dys391、dys456、dys19、dys437、dys481、dys533、dys390、dys393、gata_h4、dys439、dys576、dys458、dys635、dys448、dys438、dys385a/b。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增21個(gè)y-str基因座的19對(duì)特異性擴(kuò)增引物序列為：dys392、seq?id?no:1～2；dys389i/ii、seq?id?no:3～5；dys447、seq?id?no:6～7；dys391、seq?id?no:8～9；dys456、seq?id?no:10～11；dys19、seq?id?no:12～13；dys437、seq?id?no:14～15；dys481、seq?idno:16～17；dys533、seq?id?no:18～19；dys390、seq?id?no:20～21；dys393、seq?id?no:22～23；gata_h4、seq?id?no:24～25；dys439、seq?id?no:26～27；dys576、seq?id?no:28～29；dys458、seq?id?no:30～31；dys635、seq?id?no:32～33；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述19對(duì)特異性擴(kuò)增引物的濃度為：dys392、0.24μm；dys389i/ii、0.22μm；dys447、0.14μm；dys391、0.19μm；dys456、0.21μm；dys19、0.34μm；dys437、0.18μm；dys481、0.14μm；dys533、0.33μm；dys390、0.27μm；dys393、0.45μm；gata_h4、0.37μm；dys439、0.14μm；dys576、0.23μm；dys458、0.24μm；dys635、0.19μm；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述基因座及其19對(duì)特異性擴(kuò)增引物分為7組，具體為：dys392、dys389i/ii、dys447為第一組；dys391、dys456、dys19為第二組；dys437、dys481、dys533、dys390為第三組；dys393、gata_h4、dys439為第四組；dys576、dys458為第五組；dys635、dys448為第六組；dys438、dys385a/b為第七組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，采用熒光染料標(biāo)記7組特異性擴(kuò)增引物，且對(duì)每對(duì)引物中至少一條引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記；其中熒光染料為6-fam、hex、t13、sum、lyn、pur或h13，且每組采用的熒光標(biāo)記不同，內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光siz。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，各組引物采用的熒光染料為：第一組6-fam、第二組hex、第三組t13、第四組sum、第五組lyn、第六組pur、第七組h13。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：pcr反應(yīng)混合液、sdh2o、基因分型標(biāo)準(zhǔn)物allelic?ladder和熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)；其中，pcr反應(yīng)混合液的組成為：mgcl28.0mm，tris-hcl?145mm，kcl?135mm，dntps8.5mm，bsa?4g/l，熱啟動(dòng)taq酶2u/μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒，其特征在于，所述試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性10秒，60℃退火60秒，68℃延伸60秒，29個(gè)循環(huán)；60℃終延伸15分鐘；4℃保溫。

9.權(quán)利要求1-8任一所述快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)y-str基因座試劑盒在法醫(yī)鑒定、親緣鑒定及家系排查分析中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述法醫(yī)鑒定、親緣鑒定及家系排查針對(duì)的樣本包括：常規(guī)樣本、陳舊腐敗樣本、微量樣本和降解樣本。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了快速檢測(cè)微量降解檢材的21個(gè)Y?STR基因座試劑盒及應(yīng)用，所述試劑盒包括擴(kuò)增21個(gè)Y?STR基因座的19對(duì)特異性擴(kuò)增引物序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)勢(shì)在于：(1)本發(fā)明所述試劑盒結(jié)合八色熒光檢測(cè)技術(shù)，將試劑盒與檢測(cè)平臺(tái)深度整合，優(yōu)化檢測(cè)流程，提升檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性；(2)所述試劑盒大幅增加了350bp范圍內(nèi)的可檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，從而大幅提升對(duì)常規(guī)樣本、陳舊腐敗樣本、微量樣本、降解樣本等檢材的位點(diǎn)檢出數(shù)，從而達(dá)到法醫(yī)鑒定、親緣鑒定以及家系排查等目的；(3)在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用過(guò)程中，因試劑盒具有高精度、高效率和高通量的優(yōu)勢(shì)，因此大大提高了公安一線案件偵破效率和準(zhǔn)確性。

技術(shù)研發(fā)人員：周如華,張健,王鑫,陳維忠,秦東梅,崔揚(yáng),袁春艷,邵澤香,張雷,陳林麗,夏子芳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州市公安局
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28