本發(fā)明涉及十字花科種子活力檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種與二倍體和四倍體大白菜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大白菜(brassica?rapa?ssp.pekinensis,aa,2n＝2x＝20)是十字花科蕓薹屬的重要蔬菜作物，是中國北方地區(qū)最常食用的蔬菜。種子活力是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。種子活力是發(fā)芽率、幼苗生長勢、植株抗性和生產(chǎn)潛力的總和。種子是最基本的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，提高種子質(zhì)量是確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)高效高產(chǎn)的重要措施，對農(nóng)業(yè)及其他相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。高活力種子的特點(diǎn)是成熟充分、籽粒飽滿、貯藏穩(wěn)定性好。播種后，抗逆性強(qiáng)，發(fā)芽快而均勻，生長整齊迅速，能培育出優(yōu)質(zhì)的幼苗和植株。因此，高活力種子在生長和高產(chǎn)潛力方面具有顯著優(yōu)勢，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)現(xiàn)高效和高產(chǎn)的首要前提。目前，種子活力已成為檢驗(yàn)種子質(zhì)量的一項(xiàng)綜合指標(biāo)。

2、種子發(fā)芽試驗(yàn)和綜合分析法能準(zhǔn)確測定種子活力，但工作量大、周期長；電導(dǎo)率測定法和ttc定量法能快速測定種子活力，但結(jié)果受環(huán)境影響大，會(huì)造成種子損傷。近紅外光譜技術(shù)測定種子活力處于實(shí)驗(yàn)初期，種子形態(tài)特征主數(shù)據(jù)庫尚未建立，無法快速測定種子的特征信息；激光散射技術(shù)穩(wěn)定性低，穿透深度淺，但在物理性質(zhì)、化學(xué)成分和內(nèi)部樣品質(zhì)量等方面存在局限性，其適用范圍和效果受到一定限制。紅外熱成像技術(shù)由于種子種類繁多，結(jié)構(gòu)和形狀各不相同，因此很難根據(jù)實(shí)驗(yàn)中獲得的特定種子參數(shù)對所有種子進(jìn)行評估。傳統(tǒng)種子活力測定方法大多借用人力操作，過程復(fù)雜且耗時(shí)，會(huì)對種子造成損傷，使分析后的種子無法用于生產(chǎn)。而pcr檢測技術(shù)是一種具有靈敏度強(qiáng)和特異性高的測定種子活力的方法，與傳統(tǒng)方法相比，它具有速度快、準(zhǔn)確率高、檢測周期短、成本低等特點(diǎn)。目前還沒有利用pcr技術(shù)檢測大白菜種子活力的方法及分子標(biāo)記的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種與二倍體和四倍體大白菜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，該分子標(biāo)記能夠簡單、快速、準(zhǔn)確的區(qū)分大白菜種子活力的強(qiáng)弱。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種二倍體和四倍體大白菜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)記在如下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

4、(1)在快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力中的應(yīng)用；

5、(2)在制備快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的試劑盒中的應(yīng)用；

6、(3)在輔助大白菜育種中的應(yīng)用；

7、其中所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

8、本發(fā)明還提供一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的引物對，所述引物對的核苷酸序列如seq?id?no：2-3所示，seq?id?no：2-3所示的引物對用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記。

9、本發(fā)明還提供一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的試劑盒，含有所述的引物對。

10、本發(fā)明還提供所述的引物對或所述的試劑盒在如下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

11、(1)在快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力中的應(yīng)用；

12、(2)在制備快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的試劑盒中的應(yīng)用；

13、(3)在輔助大白菜育種中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的方法，包括以下步驟：

15、獲取待檢測大白菜種子的基因組dna，利用引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷二倍體和四倍體大白菜種子活力的強(qiáng)弱；所述引物對的核苷酸序列如seq?id?no：2-3所示。

16、優(yōu)選的是，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×taq?master?mix?5μl、引物對1μl、基因組模板dna?1μl和無菌超純水3μl。

17、優(yōu)選的是，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5mim；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃，5min；4℃，保存。

18、優(yōu)選的是，所述判斷的方法為：當(dāng)電泳結(jié)果有且僅在323bp出現(xiàn)一條帶時(shí)，則所述待測大白菜種子活力強(qiáng)；當(dāng)電泳結(jié)果在323bp不顯示條帶時(shí)，則所述待測大白菜種子活力弱。

19、本發(fā)明還提供一種檢測二倍體和四倍體大白菜種子高活力種子的方法，包括利用引物對擴(kuò)增待測大白菜種子的基因組dna，保留擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)僅在323bp出現(xiàn)一條帶的大白菜種子的步驟；所述引物對的核苷酸序列如seq?id?no：2-3所示。

20、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

21、本發(fā)明提供的鑒定大白菜種子活力的分子標(biāo)記brapyl，通過pcr擴(kuò)增觀察電泳條帶在323bp的有無，即能判斷大白菜種子活力的強(qiáng)弱。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可應(yīng)用于大白菜種子活力分子標(biāo)記輔助育種，可便捷高效篩選出強(qiáng)種子活力的大白菜品種，節(jié)本增效，促進(jìn)大白菜育種進(jìn)程，對于培育強(qiáng)種子活力大白菜新品種具有重要的理論及實(shí)踐意義。

技術(shù)特征：

1.一種二倍體和四倍體大白菜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)記在如下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

2.一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如seq?id?no：2-3所示，seq?id?no：2-3所示的引物對用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記。

3.一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物對。

4.如權(quán)利要求2所述的引物對或權(quán)利要求3所述的試劑盒在如下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

5.一種快速鑒定二倍體和四倍體大白菜種子活力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×taq?mastermix?5μl、引物對1μl、基因組模板dna?1μl和無菌超純水3μl。

7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5mim；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃，5min；4℃，保存。

8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述判斷的方法為：當(dāng)電泳結(jié)果有且僅在323bp出現(xiàn)一條帶時(shí)，則所述待測大白菜種子活力強(qiáng)；當(dāng)電泳結(jié)果在323bp不顯示條帶時(shí)，則所述待測大白菜種子活力弱。

9.一種檢測二倍體和四倍體大白菜種子高活力種子的方法，其特征在于，包括利用引物對擴(kuò)增待測大白菜種子的基因組dna，保留擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)僅在323bp出現(xiàn)一條帶的大白菜種子的步驟；所述引物對的核苷酸序列如seq?id?no：2-3所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種與二倍體和四倍體大白菜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于十字花科種子活力檢測領(lǐng)域。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄組、非靶向代謝組和全基因組甲基化測序三方面來進(jìn)行分析，最終獲得快速區(qū)分二、四倍體大白菜種子活力的分子標(biāo)記BraPYL。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過設(shè)計(jì)特異性引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記，根據(jù)電泳條帶是否僅在323bp出現(xiàn)，即可判斷大白菜種子活力強(qiáng)弱。本發(fā)明公開的分子標(biāo)記能夠快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測出活力高的大白菜種子，為輔助大白菜育種提供了新的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：孟川,劉曉東,王明秋,王清鳳,吳芳,馬小超,馬蕾,陳曉山
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6