本發(fā)明涉及生物，尤其是涉及一種用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的引物探針組合、試劑盒。

背景技術(shù)：

1、鮑曼不動桿菌(acinetobacter?baumannii,aba)為革蘭氏陰性桿菌，在環(huán)境中廣泛分布，在人體中屬于條件致病菌，該菌在醫(yī)院環(huán)境中分布廣泛，主要引起呼吸道感染，對危重患者和ccu及icu中的患者威脅很大，且其耐藥性日益嚴重。

2、嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas?maltophilia,sma)廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境，是一種非發(fā)酵需氧無芽孢的革蘭陰性桿菌，已成為目前重要的機會致病菌。該菌可以引起下呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病的急性加重并能推動某些癌癥的發(fā)生發(fā)展，如阻塞性肺癌。

3、洋蔥伯克霍爾德菌(burkholderia?cepacia,bcc)是一種革蘭氏陰性、運動性和需氧菌，具有非發(fā)酵特性，是一種機會性病原體，主要在免疫低下人群中引起疾病。由其引起的較嚴重的疾病包括肺炎或其他細菌感染疾病。

4、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌均在住院患者中常見，且感染癥狀相同，用藥有所差異，若病原體種類不能及時明確，易被誤診或忽視，導致疾病的延遲治療。目前微生物培養(yǎng)是檢測的“金標準”，但培養(yǎng)的方法操作復雜且費時費力，受患者用藥等因素的影響，導致檢出率低；熒光定量pcr檢測技術(shù)特異性強，靈敏度高，并且實行完全閉管式操作，減少了擴增產(chǎn)物的交叉污染，近年來該技術(shù)已廣泛應用于生物、醫(yī)藥、體外診斷等各個領(lǐng)域。針對鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌病原體有相關(guān)檢測試劑，但是鑒于基因片段的選擇和引物探針的設(shè)計存在不合理的現(xiàn)象，導致多數(shù)檢測試劑無法實現(xiàn)準確、快速、靈敏的檢測。

5、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供一種引物探針組合，以解決上述技術(shù)問題。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供上述引物探針組合在制備檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌產(chǎn)品中的應用。

3、本發(fā)明的第三目的在于提供一種用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的試劑盒。

4、本發(fā)明的第四目的在于提供一種非疾病診斷和治療目的的檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的方法。

5、為了實現(xiàn)以上目的，特采用以下技術(shù)方案：

6、第一方面，本發(fā)明提供了一種引物探針組合，包括用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的引物和探針；

7、用于檢測鮑曼不動桿菌的引物具有如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的核苷酸序列，用于檢測鮑曼不動桿菌的探針具有如seq?id?no.3所示的核苷酸序列；

8、用于檢測嗜麥芽窄食單胞菌的引物具有如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的核苷酸序列，用于檢測嗜麥芽窄食單胞菌的探針具有如seq?id?no.6所示的核苷酸序列；

9、用于檢測洋蔥伯克霍爾德菌的引物具有如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的核苷酸序列，用于檢測洋蔥伯克霍爾德菌的探針具有如seq?id?no.9所示的核苷酸序列。

10、作為進一步技術(shù)方案，還包括內(nèi)標引物和內(nèi)標探針；

11、所述內(nèi)標引物的核苷酸序列如seq?id?no.10和seq?id?no.11所示；

12、所述內(nèi)標探針的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

13、作為進一步技術(shù)方案，所述探針的5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有熒光淬滅基團；

14、所述熒光報告基團包括fam、rox、cy5或hex；

15、所述熒光淬滅基團包括tamra、bhq1或bhq2。

16、作為進一步技術(shù)方案，各個探針的熒光報告基團互不相同。

17、第二方面，本發(fā)明提供了上述引物探針組合在制備檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌產(chǎn)品中的應用。

18、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的試劑盒，包括上述引物探針組合和pcr預混液。

19、作為進一步技術(shù)方案，所述pcr預混液包括dntps、rtth酶、醋酸錳、mg2+和緩沖液。

20、作為進一步技術(shù)方案，還包括陰性對照和陽性對照；

21、所述陰性對照包括水；

22、所述陽性對照為鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌。

23、第四方面，本發(fā)明提供了一種非疾病診斷和治療目的的檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的方法，包括以下步驟：

24、以待測樣本的基因組dna為模板，使用上述引物探針組合或上述試劑盒進行pcr反應，根據(jù)擴增的ct值判斷待測樣品是否含有鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌。

25、作為進一步技術(shù)方案，當用于檢測鮑曼不動桿菌的引物無擴增，內(nèi)標引物有擴增且ct值≤35，則待測樣品鮑曼不動桿菌陰性；

26、當用于檢測鮑曼不動桿菌的引物有擴增且ct值≤35，則待測樣品鮑曼不動桿菌陽性；

27、當用于檢測嗜麥芽窄食單胞菌的引物無擴增，內(nèi)標引物有擴增且ct值≤35，則待測樣品嗜麥芽窄食單胞菌陰性；

28、當用于檢測嗜麥芽窄食單胞菌的引物有擴增且ct值≤34，則待測樣品嗜麥芽窄食單胞菌陽性；

29、當用于檢測洋蔥伯克霍爾德菌的引物無擴增，內(nèi)標引物有擴增且ct值≤35，則待測樣品洋蔥伯克霍爾德菌陰性；

30、當用于檢測洋蔥伯克霍爾德菌的引物有擴增且ct值≤34，則待測樣品洋蔥伯克霍爾德菌陽性；

31、當內(nèi)標引物無擴增或ct值>35，則檢測結(jié)果無效。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

33、本發(fā)明提供的引物探針組合，能夠在一個反應體系中準確、快速的同時實現(xiàn)對鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的鑒定，具有良好的特異性和靈敏度(對鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的最低檢測限為50cfu/ml)。

技術(shù)特征：

1.一種引物探針組合，其特征在于，包括用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的引物和探針；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，還包括內(nèi)標引物和內(nèi)標探針；

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物探針組合，其特征在于，所述探針的5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有熒光淬滅基團；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物探針組合，其特征在于，各個探針的熒光報告基團互不相同。

5.權(quán)利要求1-4任一項所述的引物探針組合在制備檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌產(chǎn)品中的應用。

6.一種用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1-4任一項所述的引物探針組合和pcr預混液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述pcr預混液包括dntps、rtth酶、醋酸錳、mg2+和緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括陰性對照和陽性對照；

9.一種非疾病診斷和治療目的的檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，當用于檢測鮑曼不動桿菌的引物無擴增，內(nèi)標引物有擴增且ct值≤35，則待測樣品鮑曼不動桿菌陰性；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的引物探針組合、試劑盒，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的引物探針組合，包括用于檢測鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的引物和探針，能夠在一個反應體系中準確、快速的同時實現(xiàn)對鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的鑒定，具有良好的特異性和靈敏度(對鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌的最低檢測限為50CFU/mL)。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭業(yè)煥,高歌,侯辛辛,高利飛,付光宇,吳學煒
受保護的技術(shù)使用者：鄭州安圖生物工程股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2