本發(fā)明屬于水稻耐鹽基因的檢測，具體涉及一種與水稻耐鹽性狀的相關(guān)snp位點、分子標記、引物組合及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、土壤鹽漬化會限制農(nóng)作物生長發(fā)育，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)，我國共有面積約9913萬hm2鹽堿地，主要分布在西北、東北、華北及濱海地區(qū)在內(nèi)的17個省區(qū)，可以分為輕鹽堿地、中度鹽堿地和重鹽堿地(程式華，2021)。鹽堿地是我國綜合利用潛力巨大的后備農(nóng)業(yè)耕地資源，如何利用這些鹽堿地種植農(nóng)作物，以實現(xiàn)鹽堿地糧食增產(chǎn)增收，是當今面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。

2、我國在耐鹽水稻品種的篩選和培育方面的工作已經(jīng)有70多年，主要通過耐鹽種質(zhì)的篩選鑒定和人工雜交或回(復(fù))交等傳統(tǒng)育種方法將耐鹽基因?qū)氲絻?yōu)良水稻品種中，再通過多年多代的鹽脅迫進行篩選鑒定。自2017年以來，全國掀起了一股耐鹽(堿)水稻研發(fā)的熱潮。國內(nèi)多家聯(lián)合體成立(如華東沿海秈稻組、華南沿海秈稻組、沿黃粳稻組、北方粳稻組、江蘇省耐鹽粳稻聯(lián)合體)組織相關(guān)試驗，通過國家或省級審定了鹽稻18號、鹽稻21號、中科鹽4號等多個耐鹽水稻新品種，均具有耐鹽性較好、抗病性強、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、米質(zhì)優(yōu)良等特點，正在我國沿海含鹽量0.3％～0.5％的鹽堿地上大面積推廣應(yīng)用，取得了較好的社會經(jīng)濟效益(孫明法,2022)。

3、相較于傳統(tǒng)育種方法，我國目前針對耐鹽水稻品種的選育的研究進行的聯(lián)合創(chuàng)新的重視不足。近年來，分子標記輔助育種技術(shù)迅速發(fā)展，在作物育種與新品種選育、作物基因分型與鑒定等作物遺傳改良過程中發(fā)揮著越來越重要的作用，以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所等單位為代表的我國東部沿海省份的科研育種單位，利用地處沿海地區(qū)的獨特地理位置條件，采用常規(guī)與分子育種相結(jié)合的方法，相繼育成了鹽稻10號、鹽稻12號、南粳9108、鹽豐47等耐鹽水稻新品種，已推廣應(yīng)用并產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟效益(孫明法,2022)。

4、目前，關(guān)于水稻耐鹽優(yōu)異等位基因自然變異的挖掘較少，仍然需要開發(fā)更多的分子標記對優(yōu)異的等位基因變異進行高效又準確的篩選與挖掘，以快速篩選和培育水稻耐鹽新品種。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種與水稻耐鹽性狀的相關(guān)snp位點的kasp分子標記、引物組合及應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測水稻chr8_28165515的kasp分子標記并應(yīng)用于分子標記輔助育種與基因分型，以加速分子育種進度與提高育種效率，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種與水稻耐鹽性狀的相關(guān)snp位點chr8_28165515，所述snp位點位于水稻8號染色體的28165515bp處，所述位點的堿基為a或g。

4、水稻耐鹽基因bahd啟動子區(qū)域突變體，所述突變體為8號染色體的28165515bp處由g突變?yōu)閍。

5、檢測前述的snp位點chr8_28165515或前述突變體的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品選自(1)～(5)中的任意一個：

6、(1)檢測所述相關(guān)snp位點的分子標記；

7、(2)用于檢測(1)中所述分子標記的引物組合；

8、(3)包含(2)中所述引物組合的試劑、儀器、軟件；

9、(4)用于檢測所述相關(guān)snp位點的分子標記探針；

10、(5)包含(4)中所述的探針的芯片。

11、進一步的，(1)所述分子標記為kasp標記。

12、進一步的，(2)所述引物組合包括：

13、共用下游引物(seq?id?no.3):5’-gaggtggcgcatttagtgatg-3’；

14、上游分型引物1(seq?id?no.4):5’-gaaggtgaccaagttcatgctgcaattgcaagcaacgcag-3’；

15、上游分型引物2(seq?id?no.5):5’-gaaggtcggagtcaacggattgcaattgcaagcaacgcaa-3’。

16、其中：

17、上游分型引物1(seq?id?no.4)可替換為seq?id?no.1所示上游引物:5’-gcaattgcaagcaacgcag-3’；

18、上游分型引物2(seq?id?no.5)可替換為seq?id?no.2所示下游引物:5’-gcaattgcaagcaacgcaa-3’；

19、進一步的，(4)所述分子標記探針為seq?id?no.4所示上游分型引物1的5’端修飾特異熒光標記fam，seq?id?no.5所示上游分型引物2的5’端修飾特異熒光標記hex。

20、前述的snp位點chr8_28165515，或前述突變體，或前述產(chǎn)品的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括(1)至(3)中的至少一個：

21、(1)鑒定或者輔助鑒定水稻耐鹽性狀；

22、(2)水稻種質(zhì)資源的篩選與分子標記輔助育種；

23、(3)鑒定權(quán)利要求2中所述突變體以快速分型；

24、當所述snp位點的基因型為a:a時，水稻表現(xiàn)為耐鹽表型；當所述分子標記的基因型為g:g時，水稻表現(xiàn)為鹽敏感表型。

25、進一步的，所述應(yīng)用包括以下步驟：

26、(1)提取待測群體水稻基因組dna；

27、(2)pcr檢測所述位點的snp基因型；

28、可選的，還包括(3)根據(jù)基因型進行分型，選擇確定耐鹽基因型植株作為親本進行雜交育種。

29、進一步的，步驟(2)的pcr檢測體系為：待測樣品dna?1μl,kasp?primer?mix?1μl(seq?id?no.4?0.1μl，seq?id?no.5?0.1μl，seq?id?no.3?0.267μl，dd?h2o?0.533μl，此處每種引物濃度均為0.1nmol/μl)，kasp?master?mix?1μl(kasp?master?mix母液0.5μl，ddh2o?0.5μl)；

30、pcr檢測程序為：94℃預(yù)變性15min；94℃變性20s；61-55℃退火延伸60s，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.6℃；94℃變性20s；55℃退火延伸60s，40個循環(huán)。

31、進一步的，步驟(3)中基因分型的方法為：pcr擴增程序結(jié)束后，用pherastar進行基因分型，將樣品板放入stacker進行檢測，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件kraken進行數(shù)據(jù)分析和分型可視化，根據(jù)可視化結(jié)果分類，聚合在接近x軸的顯示藍色的樣本的基因型為連接fam熒光標簽序列的g：g等位基因型，聚合在接近y軸上的顯示紅色的樣本的基因型為連接hex熒光標簽序列的a:a等位基因型，中間顯示綠色的樣本的基因型為兩種等位基因的雜合型。

32、本發(fā)明有益效果在于：

33、本發(fā)明開發(fā)了一種檢測水稻chr8_28165515位點并進行基因分型的方法，不僅可以高效、準確鑒定水稻耐鹽性，還可用該標記進行高通量的分子標記輔助選擇，進行基因分型，可視化分型結(jié)果，有效提高水稻育種效率，在水稻耐鹽品種培育的分子標記輔助選擇育種中具有重要實踐意義與應(yīng)用價值。