本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

1、塞內(nèi)卡病毒(senecavirus?a，sva)引發(fā)成年豬的口鼻黏膜水皰樣損傷、厭食、嗜睡和跛行，引發(fā)新生仔豬的急性死亡。目前，該疾病已經(jīng)在全球多個國家流行，且各日齡的的豬群都對sva易感，嚴重危害我國畜牧業(yè)的發(fā)展，對我國經(jīng)濟造成了嚴重損失。至今尚無商品化的疫苗投入生產(chǎn)使用，因此開發(fā)安全有效的疫苗是重中之重。

2、sva的基因組編碼了vp1、vp2、vp3和vp4四種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白2(viral?structural?protein?2,vp2)在誘導機體免疫應答中發(fā)揮了重要的作用。vp2作為sva的主要抗原之一，相較于vp1和vp3有著更好的免疫原性[1-2]。已有研究表明，vp2存在多個抗原決定簇，可引發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫反應[3-5]。vp2是sva誘導機體生成中和抗體的主要優(yōu)勢抗原之一，因此成為sva亞單位疫苗研究的熱點候選抗原。

3、但面臨的挑戰(zhàn)是亞單位疫苗免疫原性相對較低，因此需要加入佐劑以提高疫苗質(zhì)量并增強抗原的免疫原性。傳統(tǒng)佐劑，如鋁鹽和油乳佐劑，雖然能在一定程度上增強亞單位疫苗的免疫反應，但存在安全性和有效性不足等問題，難以滿足現(xiàn)代疫苗發(fā)展的需求。隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步，基于病原體相關(guān)分子模式(pamps)的新型佐劑逐漸成為研究熱點，展現(xiàn)出巨大的應用前景。其中鞭毛蛋白作為一種新型免疫佐劑，可通過tlr5和nlrc4信號通路誘導機體的先天性免疫應答和獲得性免疫應答。鞭毛蛋白可以與外源抗原以多種形式結(jié)合，以增強抗原的免疫效果。與將鞭毛蛋白和目的抗原混合接種機體相比，將目的抗原與鞭毛蛋白融合表達更有利于抗原和佐劑同時傳遞給表達tlr5的宿主抗原遞呈細胞(dcs)，從而提高抗原的遞呈效率[6]，因此這種融合形式可能成為構(gòu)建疫苗的一種更優(yōu)的策略。此外，將鞭毛蛋白和外源抗原融合表達還可以大大減少疫苗生產(chǎn)時間、免疫佐劑用量，從而節(jié)約生產(chǎn)成本。

4、已有的研究報道中sva-vp2蛋白的外源性表達多以包涵體形式存在，導致重組蛋白無法正確折疊，進而影響其正常生物學功能[7]。但本發(fā)明將鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原融合后，在保持鞭毛蛋白佐劑活性的同時，提高了vp2的可溶性及表達水平，大大降低了表達及純化工藝成本。本發(fā)明提供的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白可以激活tlr5通路以及活化小鼠巨噬細胞，而且生產(chǎn)流程簡單、成本低廉，對塞內(nèi)卡病毒亞單位疫苗的研究和生產(chǎn)具有重要意義。

5、參考文獻

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技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的為提供一種鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白。

2、本發(fā)明的第二目的為提供一種制備鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白的方法。

3、本發(fā)明的第三目的為提供一種融合蛋白在制備塞內(nèi)卡病毒疫苗中的應用。

4、具體包括以下內(nèi)容：

5、第一方面，本發(fā)明提供一種鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白dublin與a型塞內(nèi)卡病毒vp2抗原融合而成。進一步地，所述融合蛋白由塞內(nèi)卡病毒vp2抗原通過linker連在鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白dublin的n端。

6、優(yōu)選地，所述linker序列為ggggsggggsggggs。

7、優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。所述融合蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

8、第二方面，本發(fā)明提供了一種制備鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：

9、s1：合成編碼如權(quán)利要求4所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

10、s2：將s1所述的vp2-dublin融合蛋白基因序列通過infusion重組技術(shù)克隆入原核表達載體pet-28a(+)，獲得含編碼vp2-dublin融合蛋白的核苷酸序列的重組表達載體；

11、s3：將s2所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌rosetta(de3)菌株中，獲得用于生產(chǎn)鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白vp2-dublin的重組大腸桿菌rosetta(de3)菌株；

12、s4：以s3所述的重組菌株為種子菌株進行vp2-dublin融合蛋白的誘導表達；

13、s5：離心s4所述的菌液，獲得重組菌菌體，破碎菌體，取上清，備用；

14、s6：取s5上清液進行親和層析純化，洗脫獲得包含vp2-dublin蛋白的組分。

15、進一步地，所述s4步驟為：

16、(1)種子培養(yǎng)，將菌種劃線接種在lb平板上，37℃培養(yǎng)12-15h，挑取單菌落接種于20ml?lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)，得活化種子液；

17、(2)將步驟(1)獲得的活化種子液按照3％的接種量接入培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)至od600至0.4～0.6，加入iptg至濃度為0.1mm；

18、(3)繼續(xù)16℃160rpm誘導表達20h。

19、第三方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白在制備塞內(nèi)卡病毒疫苗中的應用。

20、本發(fā)明的有益效果：

21、1.本發(fā)明借助原核表達系統(tǒng)，以融合表達的形式表達出鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原融合蛋白，屬于首次發(fā)明。

22、2.本發(fā)明的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與塞內(nèi)卡病毒抗原的融合蛋白在保持鞭毛蛋白佐劑活性的同時，提高了vp2的可溶性及表達水平，產(chǎn)量可達40mg/l，大大降低了表達以及純化工藝成本，易于放大和規(guī)?；a(chǎn)。

23、3.本發(fā)明提供的融合蛋白顯示出良好的生物學活性，而且激活tlr5通路以及活化小鼠巨噬細胞水平顯著高于混合組(vp2+dublin)，對塞內(nèi)卡病毒亞單位疫苗的研究和生產(chǎn)具有重要意義。