本發(fā)明涉及生物檢測，特別是涉及犬冠狀病毒n蛋白的單抗、免疫膠體金試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、犬冠狀病毒(canine?coronavirus,ccov)病是一種由犬冠狀病毒引起的急性腸道感染性疾病，在全球廣泛分布，其中中國流行的基因型主要是ccov-iia型。當前，我國寵物飼養(yǎng)量逐年增加，而ccov常與犬細小病毒(cpv)、犬輪狀病毒(crv)、犬瘟熱病毒(cdv)等混合感染，診斷較為困難且容易引起大規(guī)模傳播。因此，建立一種快速診斷犬冠狀病毒病的檢測方法具有重要的公共衛(wèi)生學意義。目前，有幾種方法可用于檢測ccov，elia等利用ii型ccov的重組m蛋白(rmp)建立了elisa檢測法，然而這種方法是耗時耗力的，不適合快速和現(xiàn)場檢測；decaro等開發(fā)了一種針對m基因的rt-qpcr檢測方法，用于檢測和定量狗糞便中的ccovrna，該方法靈敏性高，但是通常需要特定的引物、熟練的技術(shù)人員和特定的設(shè)備。

2、因此，研制一種快速、靈敏的檢測技術(shù)意義重大。國內(nèi)目前用于檢測ccov的技術(shù)通常為rt-qpcr、膠體金免疫層析技術(shù)和rt-pcr。其中對于犬冠狀病毒膠體金試紙條的研發(fā)較少，試紙條價格昂貴、成本較高。因此降低檢測成本，實現(xiàn)技術(shù)的國產(chǎn)化，建立一種快速檢測方法意義重大。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供犬冠狀病毒n蛋白的單抗、免疫膠體金試紙條及其制備方法，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明研制的試紙條的敏感性優(yōu)于商品化試紙條。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、技術(shù)方案一：一株雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株命名為4a8（hybridoma?cellline?4a8），所述4a8的保藏編號為cctcc?no：c2024304，保藏日期為2024年10月18日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。

4、技術(shù)方案二：一種所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體4a8。

5、進一步地，所述單克隆抗體4a8的重鏈亞型為igg2a，輕鏈亞型為κ鏈。

6、技術(shù)方案三：所述的單克隆抗體4a8的制備方法，利用所述的雜交瘤細胞株4a8分泌產(chǎn)生。

7、技術(shù)方案四：一種所述的雜交瘤細胞株或所述的單克隆抗體4a8在制備犬冠狀病毒的檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。

8、技術(shù)方案五：一種所述的雜交瘤細胞株或所述的單克隆抗體4a8在制備防治感染犬冠狀病毒導致疾病的藥物中的應用。

9、技術(shù)方案六：一種所述的雜交瘤細胞株或所述的單克隆抗體4a8在制備犬冠狀病毒的疫苗中的應用。

10、技術(shù)方案七：一種用于檢測犬冠狀病毒n蛋白的免疫膠體金試紙條，所述免疫膠體金試紙條以權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8為金標抗體。

11、技術(shù)方案八：所述的免疫膠體金試紙條的制備方法，包括將單克隆抗體4b6噴于nc膜上作為檢測線的步驟，所述單克隆抗體4b6是由4b6雜交瘤細胞株分泌，所述4b6雜交瘤細胞株（hybridoma?cell?line?4b6）的保藏編號為cctccno：c2024305，保藏日期為2024年10月18日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學；所述單克隆抗體4b6的重鏈亞型為igg1，輕鏈亞型為κ鏈。

12、進一步地，所述制備方法還包括將羊抗鼠igg用劃線稀釋液稀釋，按照1.0ml/cm噴于nc膜上檢測線下作為質(zhì)控線的步驟。

13、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

14、本發(fā)明以原核表達并純化的ccov-n蛋白免疫小鼠，進一步篩選出具有特異性的抗ccov-n單克隆抗體。通過配對篩選，選擇了4a8作為金標抗體，4b6作為攔截抗體，建立了ccov膠體金試紙條檢測方法，該方法方便、靈敏性好，符合率高，可用于臨床ccov感染的快速檢測，以期為ccov感染的早期診斷提供依據(jù)。本發(fā)明開發(fā)的膠體金試紙條易于操作，同時可以節(jié)省時間和成本，因為它們不需要熟練的技術(shù)人員或特殊設(shè)備，可以在15min內(nèi)直接確定結(jié)果。與pcr方法相比，膠體金試紙條操作簡單、快捷，結(jié)果肉眼可見，可以用于動物醫(yī)院、大規(guī)模犬場、小型門診機構(gòu)、偏遠地區(qū)等，實現(xiàn)在臨床上的快速檢測。

技術(shù)特征：

1.一株雜交瘤細胞株，其特征在于，所述雜交瘤細胞株命名為4a8，所述4a8的保藏編號為cctcc?no：c2024304，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。

2.一種如權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體4a8。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體4a8，其特征在于，所述單克隆抗體4a8的重鏈亞型為igg2a，輕鏈亞型為κ鏈。

4.一種如權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8的制備方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株4a8分泌得到。

5.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株或權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8在制備犬冠狀病毒的檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。

6.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株或權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8在制備防治感染犬冠狀病毒導致疾病的藥物中的應用。

7.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株或權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8在制備犬冠狀病毒的疫苗中的應用。

8.一種用于檢測犬冠狀病毒n蛋白的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述免疫膠體金試紙條以權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體4a8為金標抗體。

9.如權(quán)利要求8所述的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，包括將單克隆抗體4b6噴于nc膜上作為檢測線的步驟，所述單克隆抗體4b6是由4b6雜交瘤細胞株分泌，所述4b6雜交瘤細胞株的保藏編號為cctcc?no：c2024305，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學；所述單克隆抗體4b6的重鏈亞型為igg1，輕鏈亞型為κ鏈。

10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將羊抗鼠igg用劃線稀釋液稀釋，按照1.0ml/cm噴于nc膜上檢測線下作為質(zhì)控線的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了犬冠狀病毒N蛋白的單抗、免疫膠體金試紙條及其制備方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株命名為4A8，所述4A8的保藏編號為CCTCC?NO：C2024304，以及由所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體4A8。還公開了所述的雜交瘤細胞株或所述的單克隆抗體4A8在制備犬冠狀病毒的檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。此外，本發(fā)明還公開了一種用于檢測犬冠狀病毒N蛋白的免疫膠體金試紙條及其制備方法，檢測的47份臨床樣本中，膠體金試紙條的總符合率為89.36％。本發(fā)明建立的CCoV膠體金試紙條檢測方法方便、靈敏性好，對診斷、預防和控制犬冠狀病毒病具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：張程光,劉桂坤,趙凌,趙劍清,吳穎,周明,鐘鳴,傅振芳
受保護的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6