本發(fā)明涉及分子標記輔助育種，具體地，涉及一種snp分子標記組合在雞冠長度輔助育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞冠是雞第二性征中最明顯、最重要的特征，可作為衡量性成熟程度的指標。雞冠發(fā)育是性發(fā)育的表型特征，活雞或冰鮮雞上市時，雞冠均需要達到一定的發(fā)育程度，一般要求雞冠直立、大而紅，不倒冠。雞冠長度是影響雞冠大小的重要因素，雞冠越長，一般雞冠面積越大，散熱能力越強。健康雞的雞冠一般是直立、大而紅，不健康的雞通常會雞冠較小，倒冠、雞冠發(fā)白等。雞冠是反應(yīng)雞健康狀況、抗病性和營養(yǎng)狀況的重要指標。雞冠表皮中分布較大的動脈和一些垂直排列的神經(jīng)，能夠感知外部刺激，雞冠發(fā)育是受多基因控制的數(shù)量性狀。

2、雞冠長度性狀屬于復雜的數(shù)量性狀，受到多基因控制，目前還未發(fā)現(xiàn)雞冠長度顯著相關(guān)的分子標記的報道。目前在雞冠長度育種過程中通常以直接測定雞冠長度或肉眼觀察雞冠長度進行選育，世代遺傳進展緩慢。因此，尋找雞冠長度顯著相關(guān)的分子標記，對于提高雞冠長度世代選育進展具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述雞冠長度選育進展緩慢的問題，本發(fā)明提供了一種snp分子標記組合在雞冠長度輔助育種中的應(yīng)用，通過5個與雞冠長度顯著相關(guān)的snp分子標記輔助提高雞冠長度的選育，加快雞冠長度世代選育進展。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種snp分子標記組合在雞冠長度輔助育種中的應(yīng)用，該snp分子標記對應(yīng)于ncbi中公布的雞參考基因組bgalgal1.mat.broiler.grcg7b版本序列信息，與雞冠長度顯著相關(guān)的snp分子標記相關(guān)信息如下：

3、 snp位點 染色體位置 snp?id 候選基因 參考基因組 突變位點 snp1 5:57812208 rs313797960 frmd6 c t snp2 20:11637476 rs312371971 c20orf85 g a snp3 20:11687004 rs313637016 c20orf85 g a snp4 24:1881749 rs738049404 ntm c a snp5 34:1672633 rs3388194039 lrp1 g a

4、含ferm結(jié)構(gòu)域的蛋白6(frmd6)，也稱為willin，參與神經(jīng)元分化、髓鞘形成、神經(jīng)損傷修復和囊泡分泌等生理功能。20號染色體開放閱讀框85(chromosome?20open?readingframe?85，c20orf85)參與機體免疫和雞面部色素沉著。神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrimin，ntm)基因促進駐留感覺神經(jīng)對雌激素的反應(yīng)，與雞輸卵管發(fā)育和分化、開產(chǎn)年齡等性狀的顯著相關(guān)。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low-density?lipoprotein?receptor-related?protein1，lrp1)是一種重要的信號蛋白，廣泛參與脂質(zhì)代謝、細胞運動和疾病過程等生理過程，是細胞信號傳導的關(guān)鍵介質(zhì)，對保持軟骨細胞的成熟表型具有顯著作用。

5、目前尚未有關(guān)于frmd6、c20orf85、ntm、lrp1在雞冠長度發(fā)育方面的研究報道。發(fā)明人通過gwas(genome-wide?association?studies，全基因組關(guān)聯(lián)分析)分析篩選到這些候選基因的snp位點與雞冠長度顯著相關(guān)。

6、snp分子標記的篩選方法如下：

7、以雞基因組bgalgal.mat.broiler.grcg7b(gcf_016699485.2)作為參考，采用gwas測序技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與雞冠長度顯著相關(guān)的5個區(qū)域，包括4個基因。使用spss16.0軟件的一般線性模型中的單變量方差分析進行多態(tài)性位點基因型與雞冠長度關(guān)聯(lián)分析和驗證，篩選到5個snp位點的優(yōu)勢基因型。

8、gwas是解析畜禽數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)強有力工具。利用gwas方法研究snp位點與表型值之間的關(guān)聯(lián)，能夠鑒別影響經(jīng)濟性狀的分子標記，特別適用于復雜的數(shù)量性狀。基于此，本發(fā)明通過gwas篩選雞冠長度分子標記，得到5個與雞冠長度顯著相關(guān)的snp分子標記。與候選基因和qtl連鎖分析相比，gwas標記密度高，可解析稀有、低頻變異，可分析復雜性狀的遺傳結(jié)構(gòu)，還可識別新型變異，結(jié)果更可靠。

9、上述snp分子標記的引物的核苷酸序列如下：

10、

11、具體地，提高雞冠長度的選育方法包括如下步驟：

12、(1)測定待選育雞的基因型，所述基因型為上述的snp分子標記組合的基因型；

13、(2)選留snp1位點tt優(yōu)勢基因型，snp2位點aa優(yōu)勢基因型，snp3位點aa優(yōu)勢基因型，snp4位點ca和cc優(yōu)勢基因型，snp5位點gg優(yōu)勢基因型的待選育雞為雞冠長度相對高的個體。

14、具體地，步驟(1)中，待選育雞的基因型的測定方法為：

15、(1.1)提取待測雞基因組總dna；

16、(1.2)根據(jù)snp分子標記組合，利用對應(yīng)引物對通過pcr方法擴增目標序列，所述引物對的序列為：

17、snp1f：5’ggtgacagtcctgtccctgt3’

18、snp1r：5’ggctctaaatgccctcagtg3’

19、snp2f：5’gcaatctgctagggcatgtt3’

20、snp2r：5’ccagtgcaaaaacccaaact3’

21、snp3f：5’tgggaagagcctctgttttg3’

22、snp3r：5’gcgatgctgaacattctcaa3’

23、snp4f：5’cgtccatctcctctctgtcc3’

24、snp4r：5’ccctgccatttcagatttgt3’

25、snp5f：5’ttgttctcggtctgttgcag3’

26、snp5r：5’gaccaagtccagcactgagc3’；

27、(1.3)將pcr擴增產(chǎn)物測序后，判斷基因型。

28、pcr產(chǎn)物送生物公司進行測序，將所得序列與雞的參考基因組進行比對，找出多態(tài)性位點。snp位點pcr產(chǎn)物的核苷酸序列如下所示：

29、snp1—76bp處c/t突變，pcr產(chǎn)物長度為223bp。

30、ggtgacagtcctgtccctgtgtgcaccccggggccgtgtgtgtg?cctcaggacaaggcttatataaaagtaaatak(c/t)gcacccgaggggt?ttggaagcccctgtgtggctgcgtttcttcatcgtttgtgaaaacgagtggcacaaatggaagagctcatggccagctcatggcagggctcagggagcaaacctcctggggccacactgagggcatttagagcc

31、snp2—83bp處g/a突變，pcr產(chǎn)物長度為225bp。

32、gcaatctgctagggcatgttttgaaacaattgttttttgaacctc?cactgtttgtattgcacaggaggtttggaagtatcagk(g/a)aatgtga?tgcagtgcaagtctgtcagacatgtaatgctgtcactttctttaaaataactagatcatagtttcagctgcagactgtaaattggtgttgaatctgtatggtcaaatagttatgaagtttgggtttttgcactgg

33、snp3—133bp處g/a突變，pcr產(chǎn)物長度為250bp。

34、tgggaagagcctctgttttgactgacaatgaaagagcagtgacattggccagattaaggtgtccttccttcctttaggcattctacaaaacataacacctcaaccatattattgttccacactctccctttcctgatattctcaacactctcccaagctatgtgttgak(g/a)tatgtccctctgcatgctaa?ttttacggaaggaatagtcaggagtaaaagagaattccactttgagaa?tgttcagcatcgc

35、snp4—171bp處c/a突變，pcr產(chǎn)物長度為250bp。

36、cgtccatctcctctctgtccctatgggctatttgctcctcatgtcatttttctgggatttgttggatattgggcagctctgggctgggtgtgagctctctccctgctgcacctgagctcagcctgctgtgcagcagcacgcagacacacgctgtttgatccagtgtaaaak(c/a)cagctgctacaaagtc?agcctgtcaaaaaggagtggggggggagaaaagaaaaagctgaaca?aatctgaaatggcaggg

37、snp5—167bp處g/a突變，pcr產(chǎn)物長度為207bp。

38、ttgttctcggtctgttgcagtttgtctgcaagaacgacaaatgcatccctttctggtggaaatgcgacacagaggacgactgcggggaccgttccgatgagcccgaggactgccgtgagtgctccgaaagctctgctgctctgcccaggggacagcgctgctgaagk(g/a)gggggggtcaccccgtt?gcagctcagtgctggacttggtc

39、注：以上序列中標注的k為突變位點，括號中為突變堿基，為等位基因突變。

40、優(yōu)勢基因型個體的具體判斷方法為：

41、首先分析單個snp標記與雞冠長度的相關(guān)性，5個snps位點不同基因型間雞冠長度均差異顯著，snp1(rs313797960)具有3種基因型cc、ct和tt，其中tt基因型個體的雞冠長度顯著大于ct和cc基因型個體(p＜0.05)；snp2(rs312371971)具有3種基因型aa、ga、gg，其中aa基因型個體的雞冠長度顯著大于ga和gg基因型(p＜0.05)；snp3(rs313637016)具有3種基因型aa、ga、gg，其中aa基因型個體的雞冠長度顯著大于ga和gg基因型(p＜0.05)；snp4(rs738049404)具有3種基因型aa、ca、cc，其中cc和ca基因型個體的雞冠長度顯著大于aa基因型(p＜0.05)，snp5(rs3388194039)具有3種基因型gg、ga、aa，其中g(shù)g基因型個體的雞冠長度顯著大于ga和aa基因型(p＜0.05)。采用haploview軟件分析5個snps位點的連鎖不平衡(ld)程度，發(fā)現(xiàn)snp2和snp3不處于強連鎖狀態(tài)(r2＝69<100)，其他位點也不處于強連鎖狀態(tài)，所以不再分析5個snp位點合并基因型與雞冠長度的相關(guān)性。snp1位點tt基因型，snp2位點aa基因型，snp3位點aa基因型，snp4位點cc和ca基因型，snp5位點gg基因型，為雞冠長度的優(yōu)勢基因型，可以作為雞冠長度分子輔助育種的重要分子標記。

42、通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明實現(xiàn)了以下有益效果：

43、在雞冠長度分子標記輔助育種中可以通過選留snp1位點tt優(yōu)勢基因型個體，snp2位點aa優(yōu)勢基因型個體，snp3位點aa優(yōu)勢基因型個體，snp4位點cc和ca優(yōu)勢基因型個體，snp5位點gg優(yōu)勢基因型個體，淘汰其他劣勢基因型個體的方法來輔助提高雞冠長度的選育，加快雞冠長度世代選育進展。