本發(fā)明涉及金屬離子檢測，具體而言，涉及一種基于核酸適配體單細胞測序用于金屬離子動態(tài)變化的檢測方法。

背景技術：

1、單細胞高通量測序技術的出現(xiàn)，已經(jīng)在基因組學和轉(zhuǎn)錄組學領域引發(fā)了一次革命式的研究手段轉(zhuǎn)變，基于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序可以揭示前所未有的細胞多樣性。雖然rna和蛋白質(zhì)提供了關于細胞功能的重要見解，但是鉀離子作為細胞中含量最豐富的金屬離子之一，在調(diào)節(jié)細胞電位和體積、影響細胞增殖和凋亡、神經(jīng)信號超極化、心肌細胞穩(wěn)態(tài)、細胞滲透壓等生理過程等方面發(fā)揮重要作用。此外，鉀離子(k+)還具有維持正常肌肉功能、酶活性和生理ph值的作用。因此，開展離子組的無偏量化分析對于補充單細胞離子組學具有重要潛力，可以對不同細胞狀態(tài)提供更全面的描述和表征。

2、然而，目前的分析方法在單細胞水平上監(jiān)測鉀離子穩(wěn)態(tài)的能力有限，阻礙了對單細胞水平上鉀離子動態(tài)的深入理解。目前常用的離子選擇性電極實現(xiàn)了離子濃度的直接檢測，具有較高的時間和空間分辨率，但易受其他離子的干擾，需要頻繁校準，且使用壽命短?；谛》肿拥臒晒馓结橂m然實現(xiàn)了非侵入性、操作簡便的離子監(jiān)測方式，但其準確性受到熒光信號干擾和光漂白的限制，由于生物微環(huán)境的多重干擾，只有少數(shù)熒光探針被用于生理條件下的鉀離子檢測。重要的是，盡管這些方法提供了k+的定量分析方法，但所獲得的信號只反映復雜生物樣本(如組織或血液)的平均狀態(tài)，掩蓋了個別特殊的單細胞動態(tài)。

3、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于核酸適配體單細胞測序用于金屬離子動態(tài)變化的檢測方法，稱為scion-seq。通過本發(fā)明的檢測方法能夠克服抗體在識別離子方面的限制，并且可以有效檢測到離子在單細胞水平的變化。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于分裂式核酸適配體的單細胞金屬離子動態(tài)變化的檢測方法，該分裂式核酸適配體包括第一部分和第二部分，第一部分為捕獲探針，第二部分為檢測探針；

3、檢測方法包括：將捕獲探針錨定于活細胞的膜表面，當金屬離子從活細胞中釋放到細胞外時，金屬離子作為輔因子促使檢測探針與捕獲探針結合形成穩(wěn)定的復合物；然后在單細胞細胞懸液體系中，通過對復合物結構中的檢測探針進行高通量測序，即可獲取細胞膜表面金屬離子的動態(tài)變化。

4、第二方面，本發(fā)明提供了一種分裂式核酸適配體，其包括第一部分和第二部分，第一部分為捕獲探針，第二部分為檢測探針；捕獲探針由一條基于雙烷基鏈的疏水性脂質(zhì)偶聯(lián)一條核酸適配體組成；檢測探針由一條雙端延伸了測序接頭的核酸適配體構成；測序接頭為雙端接頭，包括5’端的poly?a和3’端的捕獲序列。

5、第三方面，本發(fā)明提供了一種單細胞金屬離子動態(tài)變化的檢測試劑盒，其包括上述分裂式核酸適配體。

6、第四方面，本發(fā)明提供了一種單細胞鉀離子動態(tài)變化的檢測試劑盒，其包括上述分裂式核酸適配體，其中捕獲探針的核苷酸序列如seq?id?no:1，所述檢測探針的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

7、第五方面，本發(fā)明提供了上述檢測試劑盒在制備檢測單細胞金屬離子動態(tài)變化的產(chǎn)品中的應用。

8、第六方面，本發(fā)明提供了上述檢測試劑盒在制備用于結直腸癌患者樣本中細胞微環(huán)境的鉀離子變化分析產(chǎn)品中的應用。

9、本發(fā)明具有以下有益效果：

10、本發(fā)明利用分裂式核酸適配體對金屬離子的特異性識別能力，在靶標離子作為輔因子的情況下，該分裂式核酸適配體的兩條序列與離子結合形成復合物的特點，以及可以兼容高通量測序的特點，從而確定單個細胞微環(huán)境中的離子變化。該方法突破了傳統(tǒng)的單細胞高通量測序技術無法實現(xiàn)對生物樣本中離子檢測的瓶頸，為在單細胞水平上理解離子的生理功能提供了技術手段，也為將來推動核酸適配體在研究單細胞水平上的信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學等方面的發(fā)展奠定了基礎。

技術特征：

1.一種基于分裂式核酸適配體的單細胞金屬離子動態(tài)變化的檢測方法，其特征在于，所述分裂式核酸適配體包括第一部分和第二部分，所述第一部分為捕獲探針，所述第二部分為檢測探針；

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針由一條疏水性脂質(zhì)偶聯(lián)的核酸適配體組成。

3.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測探針由一條雙端延伸了測序接頭的核酸適配體構成；

4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述金屬離子包括的正一價和正二價的金屬離子；

5.一種分裂式核酸適配體，其特征在于，所述分裂式核酸適配體包括第一部分和第二部分，所述第一部分為捕獲探針，所述第二部分為檢測探針；

6.一種單細胞金屬離子動態(tài)變化的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求5所述的分裂式核酸適配體。

7.一種單細胞鉀離子動態(tài)變化的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求6所述的分裂式核酸適配體，所述捕獲探針的核苷酸序列如seq?id?no:1，所述檢測探針的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

8.如權利要求6或7所述的檢測試劑盒在制備檢測單細胞金屬離子動態(tài)變化的產(chǎn)品中的應用。

9.如權利要求6或7所述的檢測試劑盒在制備用于結直腸癌患者樣本微環(huán)境中的鉀離子變化分析產(chǎn)品中的應用。

技術總結
本發(fā)明公開了一種基于核酸適配體的單細胞離子動態(tài)變化的檢測方法(scIon?seq)，其包括：將疏水性脂質(zhì)修飾的捕獲探針錨定于細胞膜表面，當金屬離子從細胞中釋放到細胞外時，帶有測序接頭的檢測探針在該金屬離子的存在下與膜上的捕獲探針通過鏈間折疊形成二級結構；然后在單細胞細胞懸液體系中，通過對二級結構中帶有測序接頭的檢測探針進行高通量測序，即可獲取單細胞水平上金屬離子動態(tài)變化信息。本發(fā)明利用了核酸適配體能高特異性識別金屬離子的能力以及可以兼容高通量測序的特點，在技術層面為研究金屬離子在單細胞水平的生理功能提供了研究手段，有利于推動核酸適配體在單細胞水平上研究代謝組學、蛋白組學和轉(zhuǎn)錄組學等多組學的發(fā)展。

技術研發(fā)人員：譚蔚泓,彭瑞資,黃智勇,韓達,杜紫艷
受保護的技術使用者：中國科學院杭州醫(yī)學研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2