本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和感染病學(xué)領(lǐng)域，具體涉及乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis?b?virus,hbv)感染是最常見感染性疾病之一，嚴(yán)重危及人類的健康。盡管hbv疫苗推行了30余年，但感染仍在世界蔓延，全球約有10％人口感染hbv，其中超過2.57億人遭受慢性終身感染。目前我國(guó)的hbv感染人群大約7000萬，慢乙肝患者約2000-3000萬，約77％的肝硬化和84％的肝細(xì)胞癌是由慢乙肝所致?？共《局委熓悄壳耙腋蔚淖罡警煼?，對(duì)大多數(shù)患者非常有效，主要包括核苷(酸)類似物和干擾素治療。但是由于hbv在受感染細(xì)胞核中形成共價(jià)閉合環(huán)狀dna(cccdna)和整合序列而長(zhǎng)期存在，目前的標(biāo)準(zhǔn)療法只能抑制病毒復(fù)制，不能徹底清除hbv，hbsag也經(jīng)常不能轉(zhuǎn)陰，停藥后hbv易再激活。乙肝的慢性轉(zhuǎn)化和停藥后復(fù)發(fā)是我們現(xiàn)在面臨的嚴(yán)峻問題。

2、hbv基因組由不完全雙鏈環(huán)狀dna組成，長(zhǎng)的為負(fù)鏈，含3020-3320個(gè)堿基，短的為正鏈，含1700-2800個(gè)堿基。包括四個(gè)開放閱讀框(orf)，分別稱為c、x、p和s編碼區(qū)。c區(qū)由pre-c和c基因組成，分別由不同的起始密碼子調(diào)控，在相同的終止密碼子處結(jié)束，pre-c和c基因共同編碼pre-c蛋白，pre-c蛋白再經(jīng)過切割加工后形成e抗原(hbeag)。c基因編碼病毒的衣殼蛋白，即hbcag。s區(qū)由s基因、pres1和pres2基因組成，由3個(gè)不同的起始密碼子啟動(dòng)翻譯，在同一個(gè)終止密碼子處終止翻譯，分別編碼表面抗原(hbsag)蛋白、pres1蛋白和pres2蛋白。p區(qū)基因編碼的hbv的聚合酶蛋白(hbpol)。x區(qū)的基因編碼x蛋白(hbx)，包含154個(gè)氨基酸，是最小的一個(gè)開放閱讀框。

3、細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cytotoxic?t?lymphocyte,ctl)是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，在抗感染、抗腫瘤以及超敏反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其細(xì)胞膜上的t細(xì)胞受體(t?cell?receptor,tcr)能夠特異性識(shí)別并結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞表面mhc?i類分子與抗原肽的復(fù)合物，即mhc/抗原肽復(fù)合體分子。ctl表位是指與mhc?i類分子結(jié)合的抗原肽，是抗原分子中能被tcr特異性識(shí)別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的基本抗原單位，在ctl活化過程中扮演著關(guān)鍵角色。

4、mhc系統(tǒng)指主要組織相容性復(fù)合體(major?histocompatibility?complex,mhc)，是脊椎動(dòng)物基因組中一組緊密連鎖的基因群，編碼表達(dá)mhc?i類和ii類蛋白分子。hla(human?leukocyte?antigen)是人類的mhc系統(tǒng)，是人體最復(fù)雜的基因群，在人群中具有高度多態(tài)性。hla在抗原識(shí)別、抗原呈遞等機(jī)體免疫過程中發(fā)揮重要作用，是影響人體免疫反應(yīng)的主要因素。hla?i類分子主要負(fù)責(zé)將內(nèi)源性hbv抗原呈遞給cd8+ctl，活化的ctls通過分泌穿孔素和顆粒酶等使病毒感染的肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)分泌特定的細(xì)胞因子抑制hbv的復(fù)制。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)hbv抗原特異性cd8+t細(xì)胞的數(shù)量和功能可以準(zhǔn)確反映乙肝感染者針對(duì)hbv的特異性免疫功能狀態(tài)。由于不同人的hla分子型別不同，其對(duì)hbv不同抗原的加工、處理和提呈能力也不相同，從而引起不同程度的hbv抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)乙肝患者不同的hla分子型別，選擇其所提呈的hbv特異性抗原肽，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)該hbv抗原肽特異性的cd8+t細(xì)胞的數(shù)量和功能，對(duì)hbv感染者的疾病進(jìn)程監(jiān)測(cè)、診斷與治療方案的制定、療效觀察和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的判斷等都有重要意義，是實(shí)現(xiàn)乙肝精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療的重要技術(shù)手段。同時(shí)，利用這些hla-b分子高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原肽，還可以制備多肽疫苗或基因疫苗，預(yù)防和治療hbv感染。

5、但是，目前已明確的被各種hla分子所提呈并能刺激機(jī)體引起t細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的hbv抗原肽仍然很少，從而限制了對(duì)攜帶不同hla等位基因的乙肝患者開展特異性t細(xì)胞檢測(cè)，也限制了hbv特異性t細(xì)胞在乙肝發(fā)生發(fā)展中的作用研究，更限制了基于hla基因個(gè)體差異性及其提呈的hbv抗原肽差異性的個(gè)性化檢測(cè)和精準(zhǔn)免疫治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽及應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的第一方面，涉及乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列為如下序列中的任一種或多種：

4、sptvwlsvi；

5、lpllpiffcl；

6、cptvqaskl；

7、lpsdffpsi；

8、上述氨基酸序列單個(gè)氨基酸的去除或者更換后的氨基酸序列。

9、本發(fā)明的第二方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽在制備乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明的第三方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽的核酸分子。

11、本發(fā)明的第四方面，涉及一種核酸分子的載體。

12、本發(fā)明的第五方面，涉及一種用于治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒的疫苗，含有上述的核酸分子或上述的載體。

13、本發(fā)明的第六方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽在制備用于治療和預(yù)防乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明的第七方面，涉及上述所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽在制備檢測(cè)乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。

15、可選地，所述試劑盒包括：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法試劑、胞內(nèi)細(xì)胞因子熒光染色法試劑、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑、人類白細(xì)胞抗原多聚體熒光染色或流式細(xì)胞分析法試劑。

16、本發(fā)明的第八方面，涉及一種單克隆抗體，能夠特異性結(jié)合上述的表位肽。

17、本發(fā)明的第九方面，涉及一種用于治療乙型肝炎的藥物，包括上述的單克隆抗體。

18、更具體地說，本發(fā)明提供了新的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽，其氨基酸序列為如下所示表位肽序列中的任一種：

19、

20、

21、由上述的表格可看出，上述序列分別為乙肝病毒e抗原h(huán)beag、表面抗原h(huán)bsag的抗原肽序列，分別與hla-b5101，b1501，b4001分子呈高親和力結(jié)合，在抗原提呈細(xì)胞表面組成mhc/抗原肽復(fù)合體分子，與抗原肽特異性cd8+t細(xì)胞克隆結(jié)合，刺激其活化、增殖和分化，發(fā)揮抗乙型肝炎病毒的免疫效應(yīng)作用。

22、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列可用于制備乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗：多肽疫苗制備：按照本發(fā)明的抗原表位肽序列人工合成一種或多種抗原肽，與佐劑混合制成可溶性制劑，或者由生物納米材料裝載制成納米多肽疫苗，注入乙肝病毒感染者或乙型肝炎患者體內(nèi)，激發(fā)患者乙肝病毒抗原特異性t細(xì)胞活化、增殖，并增強(qiáng)其殺瘤細(xì)胞活性，從而制備成乙肝多肽疫苗?；蛞呙缰苽洌喊凑毡景l(fā)明的多肽序列，構(gòu)建一種多肽或多種多肽的重組dna基因片段、重組質(zhì)?；蛘咧亟M病毒載體，注入乙肝病毒感染者或乙型肝炎患者體內(nèi)，使該重組基因在體內(nèi)表達(dá)一種或多種多肽，激發(fā)乙肝病毒抗原特異性t細(xì)胞活化、增殖，并增強(qiáng)其殺病毒感染細(xì)胞的活性，從而制備成乙肝基因疫苗。

23、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列可用于制備檢測(cè)乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的檢測(cè)制劑或試劑盒：按照本發(fā)明的抗原表位肽序列，人工合成一種或多種抗原肽，在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、胞內(nèi)細(xì)胞因子熒光染色法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中，作為抗原制劑，與患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)混合培養(yǎng)，刺激乙肝病毒抗原特異性t細(xì)胞活化、增殖和分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而通過其他組合試劑檢測(cè)該細(xì)胞因子的合成量，從而反應(yīng)特異性t細(xì)胞的數(shù)量和反應(yīng)活性；也可以利用這些多肽通過基因工程技術(shù)和蛋白工程技術(shù)制備人類白細(xì)胞抗原與多肽的復(fù)合體(peptide-hla?complex)及其多聚體，再進(jìn)一步制備成熒光素標(biāo)記的制劑，用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)患者外周血pbmc細(xì)胞群中乙肝病毒抗原特異性t細(xì)胞的數(shù)量。相關(guān)試劑盒則是指由上述制劑與不同檢測(cè)方法中常用的其他試劑組裝而成的乙肝病毒抗原特異性t細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。

24、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列可用于制備治療乙型肝炎的藥物：將上述基于本發(fā)明抗原表位肽序列的多肽疫苗或基因疫苗與其他免疫治療制劑或化學(xué)治療制劑組合，制備成治療乙肝的臨床藥物。

25、本發(fā)明利用六種在線表位預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬預(yù)測(cè)hla-b分子限制性的hbv特異性抗原表位肽序列，獲得一組能分別與hla-b4601,b4001,b5801,b1502,b5101,b1301,b1302,b1501,b4006,b5401,b3501,b5201,b0702,b4403,b4801分子呈高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原表位肽序列，然后通過胞內(nèi)細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其免疫原性，為制備hbv感染的治療和預(yù)防性疫苗以及研制hbv抗原特異性t細(xì)胞檢測(cè)試劑等提供了特異性抗原肽。

26、1.選擇乙肝病毒e抗原(hbeag，包括hbcag的序列)、表面抗原(hbsag)氨基酸序列為靶向序列；

27、2.選擇預(yù)測(cè)結(jié)果獲得研究者公認(rèn)的、具有較高準(zhǔn)確性的、常用的六種表位預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)：syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen預(yù)測(cè)上述15種hla-b分子限制性的hbv特異性抗原表位肽序列；

28、3.根據(jù)一定的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)六個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，獲得六個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果較一致的候選抗原肽序列。

29、4.通過ifn-γics細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hbv抗原表位肽的免疫原性。

30、5.通過表達(dá)特定hla-b分子的hmy2.cir細(xì)胞株進(jìn)行hla-b分子的多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分析陽性表位肽與特定hla-b分子結(jié)合力。

31、6.通過接種c57bl/6j小鼠驗(yàn)證陽性表位肽在體內(nèi)刺激特異性t細(xì)胞活化增值的免疫原性。

32、本發(fā)明為乙肝病毒e抗原(hbeag，包括hbcag的序列)、表面抗原(hbsag)中能分別與hla-b*51:01，b*15:01，b*40:01分子呈高親和力結(jié)合并且具有免疫原性的抗原肽序列；還涉及到以上述抗原肽為基礎(chǔ)的乙型肝炎多肽疫苗、基因疫苗、乙型肝炎的治療與預(yù)防方法，以及以上述抗原肽為基礎(chǔ)的檢測(cè)乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的試劑和方法。

33、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下，

34、經(jīng)在線虛擬預(yù)測(cè)和功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得的hla-b5101，b1501，b4001分子限制性的hbv特異性抗原表位肽以前沒有被報(bào)道過。這些hla-b分子以前也沒有被報(bào)道有限制性的hbv抗原肽。因此這些新的抗原表位肽序列將為研制針對(duì)乙型肝炎治療性和預(yù)防性多肽疫苗和基因疫苗、設(shè)計(jì)檢測(cè)乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的試劑和方法等提供所需的關(guān)鍵抗原組分，即抗原表位肽序列；同時(shí)這些抗原表位肽也為針對(duì)這些特定hla-b等位基因的乙型肝炎患者進(jìn)行個(gè)體化檢測(cè)和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了關(guān)鍵的抗原組分。