本發(fā)明涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別是涉及一種雞原始生殖腺細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。

背景技術(shù)：

1、我國雞品種眾多，雖保留廣泛的遺傳多樣性，在品種開發(fā)利用過程中卻普遍存在著生長速度慢、飼料報(bào)酬低和腹部脂肪過量沉積等影響經(jīng)濟(jì)效益的難題?；蚓庉嬘N被認(rèn)為是解決這一難題，加快育種進(jìn)展，開發(fā)高性能品種的關(guān)鍵前沿技術(shù)。目前基因編輯技術(shù)多采用成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)和cas9蛋白編輯技術(shù)，這些技術(shù)的特點(diǎn)是需要外源引入向?qū)na和cas9及其變異酶，多采用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式。在雞種，以原始生殖腺細(xì)胞(pgcs)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用最多。在利用pgcs為載體制備基因編輯雞的過程中，需經(jīng)歷pgcs分離與擴(kuò)繁、pgcs編輯、pgcs移植等操作步驟。pgcs編輯是決定基因編輯是否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。pgcs屬于胚胎干細(xì)胞，自我保護(hù)性強(qiáng)，存在著轉(zhuǎn)染上的難題。目前多數(shù)團(tuán)隊(duì)在編輯pgcs的過程中采用電轉(zhuǎn)染，但電轉(zhuǎn)染存在著設(shè)備成本高、使用成本高和細(xì)胞需求量大等缺點(diǎn)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染因其操作快捷、安全性強(qiáng)和成本低等優(yōu)點(diǎn)，若能應(yīng)用于pgcs基因編輯，將極大的降低pgcs的編輯難度和編輯成本。

2、鑒于此，本發(fā)明提供一種雞pgcs的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染過程，成功獲得基因編輯的陽性細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)和流式分選后獲得大量基因編輯陽性細(xì)胞，用于制備基因編輯雞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種雞原始生殖腺細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，通過優(yōu)化脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染流程，以提高pgcs的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而節(jié)約基因編輯雞的制備時(shí)間和增加基因編輯雞的制備成功率。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種雞原始生殖腺細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，包括以下步驟：

4、利用opti-mem培養(yǎng)液漂洗雞原始生殖腺細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)；

5、將質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合孵育，配制轉(zhuǎn)染混合物；其中，所述質(zhì)粒包括供體質(zhì)粒和pparg打靶質(zhì)粒；

6、將所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞混合孵育。

7、優(yōu)選的是，所述漂洗的步驟包括：收集雞原始生殖腺細(xì)胞，離心，收集沉淀后用opti-mem培養(yǎng)液重懸漂洗，再次離心后，重復(fù)重懸漂洗一次。

8、優(yōu)選的是，所述雞原始生殖腺細(xì)胞漂洗后，按照接種密度為2×105～3×105個(gè)細(xì)胞/ml接種于培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。

9、優(yōu)選的是，所述供體質(zhì)粒和所述pparg打靶質(zhì)粒的質(zhì)量比為1:1。

10、優(yōu)選的是，所述供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以pmd18-t作為起始質(zhì)粒，將如seq?idno：5所示的mcherry熒光蛋白表達(dá)盒利用同源重組構(gòu)建到所述起始質(zhì)粒上的步驟。

11、優(yōu)選的是，所述pparg打靶質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括將seq?id?no：1-4所示的任意一種sgrna對(duì)應(yīng)的dna片段分別整合到px459的bbsi位點(diǎn)的步驟。

12、優(yōu)選的是，將質(zhì)粒和所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別用opti-mem培養(yǎng)液稀釋混勻后，合并兩種稀釋液，混合孵育，即得所述轉(zhuǎn)染混合物；其中，所述質(zhì)粒和所述opti-mem培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為2μg:50μl，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與所述opti-mem培養(yǎng)液的體積比為3:50。

13、優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑包括lipofectamine?stem?reagent，所述混合孵育的時(shí)間為10～15min。

14、優(yōu)選的是，將所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞混合孵育6h，所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞的體積比為100μl：1ml。

15、本發(fā)明還提供所述的方法在提高雞原始生殖腺細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

17、本發(fā)明提供的脂質(zhì)體介導(dǎo)雞pgcs轉(zhuǎn)染方法，相較于電轉(zhuǎn)染、慢病毒和腺病毒等轉(zhuǎn)染方法，脂質(zhì)體法操作便捷、設(shè)備要求低，是更加經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)染方法。本發(fā)明通過測試在轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦操作方法下(轉(zhuǎn)染流程一)和本發(fā)明優(yōu)化操作方法下(轉(zhuǎn)染作流程二)的4種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于mef飼養(yǎng)層培養(yǎng)pgcs的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染過程中通過短暫移除pgcs培養(yǎng)基，并使用opti-mem作為轉(zhuǎn)染孵育條件，能夠顯著提高轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染流程二)，高達(dá)20.8倍。在本發(fā)明優(yōu)化的操作方法下lipofectamine?2000、lipofectamine?3000、lipofectamine?stem?reagent和attractene?transfection?reagent均表現(xiàn)出0.5％以上的轉(zhuǎn)染效率，能夠滿足流式分選獲得陽性細(xì)胞的需求。lipofectamine?stem?reagent表現(xiàn)出最佳的轉(zhuǎn)染效率，其為2.65％。本發(fā)明提供了一種高效的雞pgcs轉(zhuǎn)染方法，可以顯著提高pgcs的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而利于節(jié)約基因編輯雞的制備時(shí)間和增加基因編輯雞的制備成功率。

技術(shù)特征：

1.一種雞原始生殖腺細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述漂洗的步驟包括：收集雞原始生殖腺細(xì)胞，離心，收集沉淀后用opti-mem培養(yǎng)液重懸漂洗，再次離心后，重復(fù)重懸漂洗一次。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雞原始生殖腺細(xì)胞漂洗后，按照接種密度為2×105～3×105個(gè)細(xì)胞/ml接種于培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體質(zhì)粒和所述pparg打靶質(zhì)粒的質(zhì)量比為1:1。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以pmd18-t作為起始質(zhì)粒，將如seq?id?no：5所示的mcherry熒光蛋白表達(dá)盒利用同源重組構(gòu)建到所述起始質(zhì)粒上的步驟。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述pparg打靶質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括將seqid?no：1-4所示的任意一種sgrna對(duì)應(yīng)的dna片段分別整合到px459的bbsi位點(diǎn)的步驟。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將質(zhì)粒和所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別用opti-mem培養(yǎng)液稀釋混勻后，合并兩種稀釋液，混合孵育，即得所述轉(zhuǎn)染混合物；其中，所述質(zhì)粒和所述opti-mem培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為2μg:50μl，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與所述opti-mem培養(yǎng)液的體積比為3:50。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑包括lipofectaminestem?reagent，所述混合孵育的時(shí)間為10～15min。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞混合孵育6h，所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞的體積比為100μl：1ml。

10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法在提高雞原始生殖腺細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種雞原始生殖腺細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，屬于細(xì)胞轉(zhuǎn)染領(lǐng)域。所述方法包括以下步驟：利用OPTI?MEM培養(yǎng)液漂洗雞原始生殖腺細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)；將質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合孵育，配制轉(zhuǎn)染混合物；其中，所述質(zhì)粒包括供體質(zhì)粒和PPARG打靶質(zhì)粒；將所述轉(zhuǎn)染混合物和所述原始生殖腺細(xì)胞混合孵育。本發(fā)明通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染過程，成功獲得基因編輯的陽性細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)和流式分選后獲得大量基因編輯陽性細(xì)胞，可用于制備基因編輯雞，進(jìn)而節(jié)約基因編輯雞的制備時(shí)間和增加基因編輯雞的制備成功率。

技術(shù)研發(fā)人員：張思雨,王兆川,姜自琴,莫家偉,聶慶華,黎鎮(zhèn)暉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30