本發(fā)明涉及生物檢測(cè)，具體涉及檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因的引物探針組合、檢測(cè)試劑、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、萬(wàn)古霉素屬糖肽類抗菌藥物，它是通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組分肽聚糖來(lái)干擾細(xì)胞壁的合成，抑制細(xì)胞壁中磷脂和多肽的生成。是目前治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和耐藥腸球菌等革蘭陽(yáng)性菌感染的一線用藥。

2、腸球菌(enterococcus)是醫(yī)院感染的常見(jiàn)條件致病菌。近年來(lái)，耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistant?enterococcus，vre)感染率逐年上升，7％～10％的菌血癥由腸球菌感染引起。vre可引起人體多部位感染，主要是廣譜抗菌藥物選擇性的結(jié)果。vre可通過(guò)血液感染或定植生長(zhǎng)方式進(jìn)行直接傳播，也可通過(guò)食物、醫(yī)療器械、污染環(huán)境、醫(yī)護(hù)人員接觸等方式間接傳播。vre包括耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌和耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌，有明顯的耐藥性，涉及vana、vanb、vand、vanm和vann等表型，其中vana、vanb、vand、vanm可以編碼合成d-ala-d-lac為末端的肽聚糖前體，介導(dǎo)萬(wàn)古霉素中度或高度耐藥。目前，屎腸球菌和糞腸球菌已對(duì)萬(wàn)古霉素、青霉素和替考拉寧等多種抗菌藥物產(chǎn)生抗性，快速識(shí)別耐藥細(xì)菌病原體及其特征在感染的防控工作中發(fā)揮著重要的作用，為提高對(duì)vre的防控效率，早期預(yù)防其院內(nèi)傳播，必須盡快查明耐藥腸球菌的攜帶者具有非常重要的意義。

3、現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥基因的檢測(cè)存在基因覆蓋不全、檢測(cè)方法或引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、產(chǎn)物回收后測(cè)序困難，不能用來(lái)克?。患訇?yáng)性率高等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因的引物探針組合、檢測(cè)試劑、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了快速檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因的引物探針組合，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度較高，能有效地起到準(zhǔn)確診斷、耐藥溯源、耐藥控制等作用。

2、本發(fā)明提供了引物探針組合，包括引物組x和探針x；

3、所述引物組x包括引物(2x-1)和引物2x；

4、所述引物(2x-1)具有：

5、(1)、如seq?id?no:(3x-2)所示的核苷酸序列；或

6、(2)如(1)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(1)的相同或相似；或

7、(3)、與(1)或(2)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；

8、所述引物2x具有：

9、(4)、如seq?id?no:(3x-1)所示的核苷酸序列；或

10、(5)如(4)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(4)的相同或相似；或

11、(6)、與(4)或(5)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；

12、所述探針x具有：

13、(7)、如seq?id?no:(3x)所示的核苷酸序列；或

14、(8)如(7)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(7)的相同或相似；或

15、(9)、與(7)或(8)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；

16、所述x包括1至4之間的任意一個(gè)或多個(gè)整數(shù)。

17、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，鑒定耐藥基因vana的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:1所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。

18、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，鑒定耐藥基因vanb的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:4所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:5所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:6所示的核苷酸序列。

19、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，鑒定耐藥基因vand的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:7所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:8所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:9所示的核苷酸序列。

20、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，鑒定耐藥基因vanm的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:10所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:11所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:12所示的核苷酸序列。

21、在一些實(shí)施例中，還包括內(nèi)標(biāo)基因的引物探針組，所述內(nèi)標(biāo)基因包括β-珠蛋白或gadph基因。

22、在一些具體實(shí)施例中，所述內(nèi)標(biāo)基因?yàn)棣?珠蛋白，所述β-珠蛋白的引物探針組包括：

23、(10)、正向引物具有如seq?id?no:13所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?idno:14所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:15所示的核苷酸序列；或

24、(11)如(10)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(10)的相同或相似；或

25、(12)、與(10)或(11)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

26、本發(fā)明提供了所述的引物探針組合在制備檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因的試劑或試劑盒中的應(yīng)用：

27、所述耐藥基因包括vana、vanb、vand和vanm中的至少一種。

28、本發(fā)明提供了試劑，包括所述的引物探針組合，以及可接受的輔料和助劑。

29、本發(fā)明提供了試劑盒，包括所述的引物探針組合或所述的試劑，以及pcr反應(yīng)試劑。

30、在一些實(shí)施例中，所述pcr反應(yīng)試劑包括：buffer、dntps、dna聚合酶、樣品dna、mgcl2和h2o。

31、在一些實(shí)施例中，所述pcr反應(yīng)試劑包括dutp。

32、在一些具體實(shí)施例中，所述buffer包括：

33、

34、

35、在一些具體實(shí)施例中，

36、所述buffer包括：

37、

38、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述試劑盒的pcr反應(yīng)體系包括：

39、

40、在一些實(shí)施例中，所述pcr的反應(yīng)程序包括：

41、

42、本發(fā)明還提供了如下任意項(xiàng)在檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因vana、vanb、vand和vanm中的應(yīng)用：

43、i、所述的引物探針組合；和/或

44、ii、所述的試劑；和/或

45、iii、所述的試劑盒。

46、本發(fā)明提供了如下任意項(xiàng)在篩選抗耐萬(wàn)古霉素細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用：

47、i、所述的引物探針組合；和/或

48、ii、所述的試劑；和/或

49、iii、所述的試劑盒。

50、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述應(yīng)用為非疾病的診斷或治療目的。

51、本發(fā)明提供了檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因的引物探針組合、檢測(cè)試劑、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，由于不同種類的抗菌藥物對(duì)產(chǎn)生不同萬(wàn)古霉素菌株的體外抗菌活性不同，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，最可靠，最直接的方法，且用時(shí)較短50min，，本試劑盒可以檢測(cè)萬(wàn)古霉素的耐藥基因更全面，可以檢測(cè)vana，vanb，vand，vanm，且靈敏度比較高，檢測(cè)限濃度為50copies/ml，有利于臨床抗感染治療的精準(zhǔn)用藥和醫(yī)院感染預(yù)防控制。