本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種用于高毒力肺炎克雷伯菌實時熒光mira檢測的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺炎克雷伯菌(klebsiella?pneumoniae)是一種廣泛存在于環(huán)境的重要人獸共患病原菌，可以通過污染食物鏈和水源等方式傳播給人類，引起嚴(yán)重的社區(qū)及醫(yī)院獲得性感染。20世紀(jì)80年代研究人員首次報道了高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentk.pneumoniae，hvkp)，相比普通肺炎克雷伯菌，hvkp具有更高的侵襲性和感染能力，能引起更加廣泛且嚴(yán)重的感染，如肝膿腫、壞死性筋膜炎和腦膜炎等。

2、傳統(tǒng)鑒定高毒力肺炎克雷伯菌主要通過拉絲試驗(string?test)及檢測莢膜抗原血清型的方法，然而這些方法的敏感性和特異性不足，時間成本高，無法準(zhǔn)確區(qū)分hvkp，且對操作者依賴性強。因此，在實踐中具有急迫需要尋找一種簡單、準(zhǔn)確且快速的鑒定方法。隨著基因組測序及分子生物學(xué)進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)iuca、peg-344、irob、p-rmpa和p-rmpa2等基因可作為鑒定hvkp的精確標(biāo)志物。開發(fā)基于這些基因的分子生物學(xué)快速診斷技術(shù)對于防控hvkp傳播具有重要現(xiàn)實意義。

3、常規(guī)pcr測序等傳統(tǒng)核酸檢測方法耗時耗力，需要專業(yè)的pcr設(shè)備和有經(jīng)驗的操作人員，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。近年來，一種新的恒溫擴(kuò)增技術(shù)-多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)(multienzyme?isothermal?rapid?amplification，mira)因其簡單快速，高靈敏性及不需要專業(yè)設(shè)備等優(yōu)點，受到研究人員的廣泛關(guān)注。然而目前尚無基于實時熒光定量mira(real-time?mira)的hvkp快速診斷方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于高毒力肺炎克雷伯菌實時熒光mira檢測的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明提供的引物探針組合能夠特異性且快速的檢測高毒力肺炎克雷伯菌，還具有靈敏度高的優(yōu)勢。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供了一種用于高毒力肺炎克雷伯菌實時熒光mira檢測的引物探針組合，所述引物探針組合包括核苷酸序列如seq?id?no.7所述的上游引物、核苷酸序列如seq?idno.8所述的下游引物和核苷酸序列如seq?id?no.9所述的探針(熒光探針)。

4、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述探針自5’端起第30位堿基t標(biāo)記fam發(fā)光基團(tuán)，第31位堿基被四氫呋喃thf代替，第32位堿基t標(biāo)記bhq1淬滅基團(tuán)，3’端進(jìn)行c3spacer阻斷修飾。

5、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述高毒力肺炎克雷伯菌為攜帶iucabcd基因簇的肺炎克雷伯菌。

6、本發(fā)明針對高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因iuca，特異性設(shè)計了適用mira檢測的引物和探針，該引物探針組合和含有該引物探針組合的產(chǎn)品特別適用于對高毒力肺炎克雷伯菌的現(xiàn)場篩查，具有檢測速度快、特異性好、不受假陽性和交叉污染等干擾、結(jié)果可靠、靈敏度高(檢測限為1.68×100pg/ml或8×100cfu/ml)且特異性強的優(yōu)勢。由此可見，本發(fā)明提供的引物探針組合能夠用于制備檢測和/或輔助檢測高毒力肺炎克雷伯菌的產(chǎn)品。

7、本發(fā)明提供了上述的引物探針組合在制備檢測和/或輔助檢測高毒力肺炎克雷伯菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

8、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述應(yīng)用的場景包括宰線環(huán)節(jié)(宰殺、開膛、沖洗、分割)、生產(chǎn)車間(清洗、調(diào)配、分選、加熱、包裝)以及肉、蛋、奶制產(chǎn)品倉儲、運輸、銷售環(huán)節(jié)涉及的各種器械、臺面、空間環(huán)境和人類醫(yī)療環(huán)境等。

9、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述人類醫(yī)療環(huán)境包括各種醫(yī)療衛(wèi)生體系；所述各種醫(yī)療衛(wèi)生體系包括大中小型醫(yī)院、診所、社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心和衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)的診療器械以及空間環(huán)境等。

10、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品包括試劑、試劑盒和芯片。

11、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述試劑盒優(yōu)選為mira檢測試劑盒。

12、本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或輔助檢測高毒力肺炎克雷伯菌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括上述的引物探針組合。

13、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品還包括dna快速提取試劑、反應(yīng)緩沖液和凍干酶粉。

14、優(yōu)選的，所述dna快速提取試劑包括chelex-100、溶菌酶和tris-edta緩沖液；所述chelex-100、所述溶菌酶和所述tris-edta緩沖液的質(zhì)量體積比為5g：200mg：100ml；

15、所述反應(yīng)緩沖液包含20mm?tris-hcl、15mm(nh4)2so4、50mm?kcl、5mm?mgso4、0.1wt.％tween-20、1.5mm?dntps、0.6mg/mlbsa、4mmatp、30mm磷酸肌酸、5.5％(w/v)聚乙二醇20000和2mm二硫蘇糖醇；

16、所述凍干酶粉包括50μg/mlbst?dna聚合酶、10μg/mlnt.bstnbi核酸內(nèi)切酶、0.5mg/ml單鏈dna結(jié)合蛋白、500ng/mluvsx重組酶和200ng/μl肌酸激酶。

17、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品包括試劑和試劑盒。

18、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述試劑盒優(yōu)選為mira檢測試劑盒。

19、本發(fā)明提供了上述的引物探針組合或上述的產(chǎn)品在非診斷和治療目的的檢測高毒力肺炎克雷伯菌中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明提供了一種非診斷和治療目的的檢測高毒力肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步驟：

21、以待測樣品的dna基因組為模板dna，將模板dna和上述的引物探針組合混合后進(jìn)行恒溫反應(yīng)，進(jìn)行實時熒光mira檢測；若出現(xiàn)熒光，則判斷待測樣品中含有高毒力肺炎克雷伯菌。

22、優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的溫度為37-42℃，時間為15-20min。

23、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的溫度為39℃，時間為20min。

24、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述待測樣品為菌株、拭子和牛奶，但不限于菌株、拭子和牛奶。

25、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述實時熒光mira檢測過程中每30s采集一次熒光信號(信號采集通道的選擇與探針設(shè)計一致)。

26、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

27、本發(fā)明針對高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因iuca，特異性設(shè)計了適用mira檢測的引物和探針，該引物探針組合和含有該引物探針組合的產(chǎn)品特別適用于對高毒力肺炎克雷伯菌的現(xiàn)場篩查，具有檢測速度快、特異性好、不受假陽性和交叉污染等干擾、結(jié)果可靠、靈敏度高(檢測限為1.68×100pg/ml或8×100cfu/ml)且特異性強的優(yōu)勢，適合食品檢驗、疾病控制中心、質(zhì)量監(jiān)督部門使用。由此可見，本發(fā)明提供的檢測高毒力肺炎克雷伯菌的引物探針組合及配套的產(chǎn)品(試劑和mira檢測試劑盒)能夠有效檢測高毒力肺炎克雷伯菌。

28、同時經(jīng)過多酶恒溫擴(kuò)增和熒光信號檢測，本發(fā)明提供的特異性的mira引物探針組合可快速鑒定樣本是否含有高毒力肺炎克雷伯菌。而且，本發(fā)明提供的檢測方法具有快速、低成本、操作簡單和不需要專業(yè)設(shè)備的優(yōu)點，適合現(xiàn)場快速檢測。