本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種能夠錨定解脂耶氏酵母的大腸桿菌及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

1、赤蘚糖醇是一種白色、無(wú)臭、不吸濕、熱穩(wěn)定的結(jié)晶性粉末，赤蘚糖醇入口清涼，且具有低熱量、非致齲、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮等優(yōu)勢(shì)，因此其被廣泛應(yīng)用于多種食品，如烘焙食品、發(fā)酵牛奶、糖果和巧克力等。真菌和細(xì)菌均能合成赤蘚糖醇，目前赤蘚糖醇的生產(chǎn)菌種主要是解脂耶氏酵母。鑒于赤蘚糖醇重要的應(yīng)用價(jià)值和巨大的市場(chǎng)需求，選育高產(chǎn)、低成本、遺傳穩(wěn)定性好的生產(chǎn)菌株已成為該行業(yè)的關(guān)鍵目標(biāo)，但目前尚無(wú)高效的赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株高通量選育方法，因此選育發(fā)酵性能優(yōu)良的赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株仍是一項(xiàng)富有意義的工作。

2、生物傳感器是一組微生物體內(nèi)廣泛存在的響應(yīng)系統(tǒng)，用于識(shí)別并響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)特定的代謝物，并將其轉(zhuǎn)化為特定的響應(yīng)信號(hào)，如熒光。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在各類(lèi)生物傳感器中為最主要的一類(lèi)，它可以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)特定代謝物的濃度，并控制響應(yīng)信號(hào)蛋白的表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子被誘導(dǎo)后，響應(yīng)信號(hào)蛋白產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)與代謝物濃度呈正相關(guān)，常用的響應(yīng)信號(hào)蛋白是熒光蛋白，利用熒光作為響應(yīng)信號(hào)的主要優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的高通量篩選，這在分析大量突變酶或突變菌方面大大提高了效率。目前生物傳感器已被廣泛用于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的定性與定量分析，也被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)。

3、為了進(jìn)一步提高傳感器的響應(yīng)效率，酵母細(xì)胞表面工程中酵母細(xì)胞具有將啟動(dòng)子轉(zhuǎn)換為信號(hào)的能力?；诮湍缸陨韮?yōu)勢(shì)，酵母表面展示系統(tǒng)被認(rèn)為是安全、高效、具有應(yīng)用價(jià)值的系統(tǒng)。酵母細(xì)胞展示技術(shù)的一個(gè)重要任務(wù)是研究一種高效的錨定蛋白，它要求細(xì)胞生產(chǎn)大量錨定蛋白的同時(shí)還能在細(xì)胞表面高效顯示，從而為目標(biāo)蛋白與底物的結(jié)合提供更多的空間。在酵母細(xì)胞中錨定蛋白與細(xì)胞連接方式存在兩種類(lèi)型，一種為蛋白與細(xì)胞壁非共價(jià)銜接，另一種為蛋白與細(xì)胞壁共價(jià)銜接。共價(jià)型銜接細(xì)胞壁的錨定蛋白依據(jù)其銜接形式，可劃分為gpi型和pir型；非共價(jià)連接的細(xì)胞壁蛋白主要為flo1p的n端絮凝系統(tǒng)。gpi型錨定蛋白在細(xì)胞表面展示異源蛋白的表達(dá)中起著重要作用，對(duì)酵母展示技術(shù)的研究是必不可少的。gpi型錨定蛋白融合方式分為n-末端融合與c-末端融合，具備代表性的則為α-凝集素和a-凝集素。酵母細(xì)胞中g(shù)pi錨定蛋白的糖脂部分與疏水性蛋白的c-末端連接，以確保膜與蛋白穩(wěn)定結(jié)合。融合蛋白完成后，蛋白前體物質(zhì)被錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其余蛋白留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。最終通過(guò)錨定蛋白的作用將具有一定功能的蛋白固定在細(xì)胞表面，釀酒酵母作為酵母細(xì)胞表面顯示平臺(tái)的優(yōu)質(zhì)酵母，已在展示各種酶中得到應(yīng)用。新的錨定蛋白的挖掘已成為研究熱點(diǎn)，vaart開(kāi)發(fā)了許多細(xì)胞壁蛋白，如cwp1p，cwp2p，tip1p，sed1p，ycr89w，tirl等，這些蛋白被證實(shí)可作為n端顯示平臺(tái)的連接蛋白。yang等人研究了新的表面展示系統(tǒng)，包括dan4p，sed1p，pry3p，tos6p，cwp2p，srp2p和α-凝集素，并研究了這些展示系統(tǒng)的顯示效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)aga1p和dan4p更適合固定較大的蛋白質(zhì)。目前，在噬菌體和細(xì)菌展示系統(tǒng)構(gòu)建生物傳感器的研究較多，而在酵母中的研究相對(duì)較少。比如在大腸桿菌中展示谷氨酸脫氫酶構(gòu)建生物傳感器，通過(guò)與碳納米材料組裝成正負(fù)電極，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的濃度的檢測(cè)。

4、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn?111996132?a(申請(qǐng)?zhí)?02010708696.9)發(fā)明提供了一種解脂耶氏酵母細(xì)胞表面展示方法，涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，以解脂耶氏酵母菌為底盤(pán)細(xì)胞，以pycsd為載體，使用xpr2?pre分泌信號(hào)肽引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)向胞外分泌，使用解脂耶氏酵母內(nèi)源的ylcwp1(110)作為細(xì)胞表面錨定信號(hào)，使用柔性連接肽(g4s)2連接目的基因和ylcwp1(110)，從而減少對(duì)目的蛋白表達(dá)和折疊的影響。將目的基因克隆到pycsd的克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，實(shí)現(xiàn)目的蛋白在解脂耶氏酵母細(xì)胞的表面展示。

5、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn?117737066?a(申請(qǐng)?zhí)?02311769795.8)發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及其應(yīng)用，該轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所公開(kāi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列進(jìn)行突變獲得，相比于現(xiàn)有技術(shù)，采用突變后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列所制備的重組大腸桿菌能夠在篩選赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的過(guò)程中有效降低背景熒光強(qiáng)度，且熒光響應(yīng)信號(hào)是現(xiàn)有技術(shù)的6.5倍，顯著提高了赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的篩選效率。

6、研究開(kāi)發(fā)一種能夠快速檢測(cè)赤蘚糖醇濃度并且能夠高效篩選赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的錨定蛋白基因工程菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種能夠錨定解脂耶氏酵母細(xì)胞表面的大腸桿菌及其應(yīng)用方法。

2、發(fā)明人篩選出一種能夠錨定解脂耶氏酵母細(xì)胞表面的基因工程菌，能夠表面展示錨定蛋白cwp2。將錨定蛋白重組大腸桿菌e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2與解脂耶氏酵母包埋共培養(yǎng)，使用重組大腸桿菌e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2作為生物傳感器來(lái)檢測(cè)解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出赤蘚糖醇的濃度響應(yīng)信號(hào)是原始菌株的10.5倍。利用重組大腸桿菌作為生物傳感器來(lái)篩選解脂耶氏酵母高產(chǎn)赤蘚糖醇突變菌，最終獲得一株突變菌y.lipolytica?5-14-e6的赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到178g/l。

3、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

4、錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1在篩選赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用，所述錨定蛋白的核苷酸序列分別為seq?id?no.1，seq?id?no.2，seq?id?no.3，seq?id?no.4，seqid?no.5。

5、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述應(yīng)用中，錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1分別與冰核蛋白inp融合，所述冰核蛋白inp的氨基酸序列為seq?id?no.7。

6、一種重組質(zhì)粒，包括錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1的核苷酸序列；

7、所述錨定蛋白的核苷酸序列分別為seq?id?no.1，seq?id?no.2，seq?id?no.3，seqid?no.4，seq?id?no.5；

8、錨定蛋白cwp2的核苷酸序列不局限于seq?id?no.3，還包括編碼錨定蛋白cwp2氨基酸序列seq?id?no.6的其他核苷酸序列。

9、根本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒還包括冰核蛋白inp的核苷酸序列；

10、所述核苷酸序列為編碼冰核蛋白inp氨基酸序列seq?id?no.7的核苷酸序列；

11、進(jìn)一步優(yōu)選的，冰核蛋白inp的核苷酸序列為seq?id?no.13。

12、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒還包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列、編碼阻遏蛋白的基因序列、編碼熒光蛋白的標(biāo)記基因序列；

13、所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的核苷酸序列為seq?id?no.9、編碼阻遏蛋白的基因序列為seqid?no.10、編碼熒光蛋白的標(biāo)記基因序列為seq?id?no.11。

14、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒為將錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1與冰核蛋白inp的基因進(jìn)行融合，插入到核苷酸序列seq?id?no.12的salⅰ和bamhi酶切位點(diǎn)間。

15、一種重組工程菌，包含上述的重組質(zhì)粒。

16、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組工程菌的宿主菌為大腸桿菌。

17、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述宿主菌為大腸桿菌bl21(de3)。

18、一種大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

19、(1)將錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1的基因與冰核蛋白inp基因進(jìn)行融合表達(dá)，均插入到核苷酸序列seq?id?no.12的salⅰ和bamhi酶切位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體pet-22b(+)-eryd-inp-sed1、pet-22b(+)-eryd-inp-agα1、pet-22b(+)-eryd-inp-egt2、pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2、pet-22b(+)-eryd-inp-dan4；

20、所述錨定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4、sed1的核苷酸序列分別為seq?id?no.1，seqid?no.2，seq?id?no.3，seq?id?no.4，seq?id?no.5，冰核蛋白inp的核苷酸序列為seq?idno.13；

21、(2)將步驟(1)得到的重組表達(dá)載體pet-22b(+)-eryd-inp-sed1、pet-22b(+)-eryd-inp-agα1、pet-22b(+)-eryd-inp-egt2、pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2或pet-22b(+)-eryd-inp-dan4，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，經(jīng)篩選、鑒定后，得到大腸桿菌基因工程菌e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-sed1，e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-agα1，e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-egt2，e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2，e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-dan4。

22、上述重組質(zhì)粒、重組工程菌、所述方法構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌在篩選赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。

23、一種篩選赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株中的方法，包括如下步驟：

24、將上述重組工程菌或大腸桿菌基因工程菌接種到培養(yǎng)基培養(yǎng)，將待篩選菌株接種到培養(yǎng)基培養(yǎng)，取二者發(fā)酵液混合，根據(jù)發(fā)酵液的熒光強(qiáng)度即可確認(rèn)待篩選菌株的赤蘚糖醇生產(chǎn)能力。

25、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，將上述重組工程菌或大腸桿菌基因工程菌接種到lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，將解脂耶氏酵母接種到y(tǒng)pd培養(yǎng)基培養(yǎng)，取二者發(fā)酵液混合，根據(jù)發(fā)酵液的熒光強(qiáng)度即可確認(rèn)待篩選菌株的赤蘚糖醇生產(chǎn)能力。

26、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株為解脂耶氏酵母。

27、上述重組質(zhì)粒、重組工程菌、所述方法構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌在檢測(cè)赤蘚糖醇濃度中的應(yīng)用。

28、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述重組質(zhì)粒、重組工程菌、所述方法構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌作為生物傳感器在檢測(cè)赤蘚糖醇濃度中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明未作出詳細(xì)說(shuō)明的步驟均按照本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行。

30、有益效果

31、1、本發(fā)明提供的重組大腸桿菌在解脂耶氏酵母細(xì)胞表面上能夠展示出較好的錨定狀態(tài)，可以利用重組大腸桿菌作為生物傳感器來(lái)檢測(cè)解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇的情況，能夠用于快速檢測(cè)赤蘚糖醇的濃度，也能夠用于篩選解脂耶氏酵母高產(chǎn)赤蘚糖醇突變菌。

32、2、本發(fā)明提供了一種能夠錨定解脂耶氏酵母細(xì)胞表面的基因工程菌，能夠表面展示錨定蛋白cwp2，將錨定蛋白重組大腸桿菌e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2與解脂耶氏酵母包埋共培養(yǎng)，使用重組大腸桿菌e.coli?bl21/pet-22b(+)-eryd-inp-cwp2作為生物傳感器來(lái)檢測(cè)解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出赤蘚糖醇的濃度響應(yīng)信號(hào)是原始菌株的10.5倍，利用重組大腸桿菌作為生物傳感器來(lái)篩選解脂耶氏酵母高產(chǎn)赤蘚糖醇突變菌，最終獲得一株突變菌y.lipolytica?5-14-e6的赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到178g/l。