本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種高產(chǎn)蝦青素的需鈉弧菌工程菌及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、蝦青素(3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮)是一種酮式胡羅卜素，分子式為c40h52o4，由8個異戊二烯單元組成。蝦青素是目前發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑，其抗氧化能力是維生素e的550倍、β-胡蘿卜素的10倍，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥原料、化妝品成分以及著色劑產(chǎn)品。全球蝦青素市場預(yù)計在2027年達(dá)到大約34億美元，年復(fù)合增長率在16.2％上下，蝦青素是一種具有較高應(yīng)用需求的抗氧化劑。

2、目前蝦青素的生產(chǎn)有3種方式：化學(xué)合成法、提取法、生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)的是左旋和右旋異構(gòu)體的混合物，工藝復(fù)雜，污染較大。提取法是從水產(chǎn)品廢棄物中用物理和化學(xué)方法提取，產(chǎn)量低，同樣有污染較大的問題。生物發(fā)酵法使用紅法夫酵母或雨生紅球藻進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，優(yōu)點是生物安全、污染小，缺點是紅法夫酵母產(chǎn)生的蝦青素為右旋，培養(yǎng)時間需要一周左右，而雨生紅球藻雖然產(chǎn)生的是左旋蝦青素，但是培養(yǎng)時間更長，通常要到2周以上。

3、隨著微生物表達(dá)系統(tǒng)的不斷發(fā)展，人們常常借助原核生物表達(dá)異源基因來提高生產(chǎn)技術(shù)，然而此種方法仍然存在弊端，例如大腸桿菌作為宿主時，無論是電轉(zhuǎn)還是化轉(zhuǎn)，均需對宿主細(xì)胞進(jìn)行前處理，需要花費較多的時間。

4、因此，目前急需借助一種能夠快速構(gòu)建并表達(dá)異源基因的菌株來提高蝦青素生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)蝦青素的需鈉弧菌工程菌，該工程菌能提高蝦青素產(chǎn)量，并降低工業(yè)生產(chǎn)蝦青素的成本。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)蝦青素的工程菌，所述工程菌的基因組中整合了天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒；

4、所述天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒包括蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列和合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列，其核苷酸序列如seq?id?no8-10所示。

5、優(yōu)選地，所述蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列包括β-caratene合成酶crty、crtb、crti、crte基因簇；啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010。

6、優(yōu)選地，所述異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列包括異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶、啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010；合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列包括crtw和crtz、啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010。

7、優(yōu)選地，所述工程菌由重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌并將蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列和合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列插入到需鈉弧菌基因組得到，所述重組質(zhì)粒由tfox重組蛋白基因、氨芐青霉素抗性基因和溫敏型復(fù)制子sc101的編碼基因通過重疊延伸pcr后無縫克隆連接構(gòu)建而成。

8、更優(yōu)選地，所述宿主菌為需鈉弧菌atcc14048。

9、本發(fā)明還提供了一種高產(chǎn)蝦青素工程菌的構(gòu)建過程，包括將異源表達(dá)tfox蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，再將上述天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒插入宿主菌基因組中，構(gòu)建高產(chǎn)蝦青素工程菌。

10、優(yōu)選地，所述異源表達(dá)tfox蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟：

11、s1、以質(zhì)粒pkd46為模板擴增ampr序列，得到產(chǎn)物ampr-a；以質(zhì)粒pkd46為模板擴增溫敏啟動子sc101序列，得到產(chǎn)物sc101-a；

12、s2、人工合成tfox序列(organism:vibrio?cholerae(strain:rfb16)，locus?tag:f0316_rs08345)，以合成的tfox序列為模板擴增，得到產(chǎn)物tfox-a，并以tfox-a序列為模板擴增，得到產(chǎn)物tfox-b；

13、s3、以ampr-a、sc101-a為模板擴增，得到產(chǎn)物ampr-sc101；

14、s4、一步克隆法，使ampr-sc101和tfox-b構(gòu)成重組質(zhì)粒。

15、優(yōu)選地，所述工程菌為需鈉弧菌；所述構(gòu)建需鈉弧菌工程菌過程分別以需鈉弧菌的dns、wbff、pta基因上下游各500bp作為同源臂，將蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列和合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列插入需鈉弧菌基因組。

16、本發(fā)明還提供了上述工程菌或上述構(gòu)建過程在高產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。

17、優(yōu)選地，高產(chǎn)蝦青素的應(yīng)用過程中還包括將工程菌以補料工藝進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)生成蝦青素。

18、本發(fā)明的有益效果：

19、1、本發(fā)明以需鈉弧菌作為發(fā)酵底盤，設(shè)計了新的代謝途徑組合策略，通過引入β-類胡蘿卜素和左旋蝦青素的合成基因，實現(xiàn)了在需鈉弧菌快速發(fā)酵生成左旋蝦青素的目的。

20、2、本發(fā)明通過同源重組技術(shù)，將優(yōu)化后的多個天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)入需鈉弧菌基因組，構(gòu)建成功vn92-ast工程菌株，實現(xiàn)了異源發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。

21、3、本發(fā)明通過補料工藝發(fā)酵vn92-ast菌株，經(jīng)68h培養(yǎng)生成蝦青素最高產(chǎn)量為732mg/l，充分說明本發(fā)明構(gòu)建的菌株提高了蝦青素產(chǎn)量，降低了工業(yè)生產(chǎn)蝦青素的成本。

技術(shù)特征：

1.一種高產(chǎn)蝦青素的工程菌，其特征在于，所述工程菌的基因組中整合了天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述工程菌，其特征在于，所述蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列包括β-caratene合成酶crty、crtb、crti、crte基因簇；啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述工程菌，其特征在于，所述異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列包括異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶、啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010；合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列包括crtw和crtz、啟動子為需鈉弧菌組成型啟動子，終止子為bba_b0010。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述工程菌，其特征在于，所述工程菌由重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌得到，所述重組質(zhì)粒由tfox重組蛋白基因、氨芐青霉素抗性基因和溫敏型復(fù)制子sc101的編碼基因通過重疊延伸pcr后無縫克隆連接構(gòu)建而成。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述工程菌，其特征在于，所述宿主菌為需鈉弧菌atcc14048。

6.一種高產(chǎn)蝦青素工程菌的構(gòu)建過程，其特征在于，包括將異源表達(dá)tfox蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，再將權(quán)利要求1所述天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒插入宿主菌基因組中，構(gòu)建高產(chǎn)蝦青素工程菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建過程，其特征在于，所述異源表達(dá)tfox蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建過程，其特征在于，所述工程菌為需鈉弧菌；所述構(gòu)建需鈉弧菌工程菌過程分別以需鈉弧菌的dns、wbff、pta基因上下游各500bp作為同源臂，將蝦青素前體合成途徑表達(dá)盒序列、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶序列和合成蝦青素的基因表達(dá)盒序列插入需鈉弧菌基因組。

9.權(quán)利要求1-5任一項所述工程菌或權(quán)利要求6所述構(gòu)建過程在高產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，包括將權(quán)利要求6構(gòu)建的工程菌以補料工藝進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)生成蝦青素。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)蝦青素的工程菌、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)tfox基因的質(zhì)粒pVJ_tfox_amp_sc101，并將其轉(zhuǎn)化需鈉弧菌ATCC14048，然后通過同源重組技術(shù)，將優(yōu)化后的多個天然蝦青素合成途徑上的基因表達(dá)盒插入需鈉弧菌基因組，成功構(gòu)建了Vn92?ast工程菌株，實現(xiàn)異源發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。本發(fā)明實施例表明，以補料工藝發(fā)酵Vn92?ast菌株，培養(yǎng)生產(chǎn)的蝦青素產(chǎn)率高，具備工業(yè)生產(chǎn)潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：賈佩嶠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6