本發(fā)明涉及生物工程，具體為一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前具有相對(duì)較高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶主要有t4噬菌體來源為220μmol/mg/min，t2噬菌體來源為430μmol/mg/min，equus?asinus來源為730μmol/mg/min，但這三者在大腸桿菌bl21(de3)中重組表達(dá)幾乎沒有上清表達(dá)，streptococcus?mutans來源的脫氧胞苷酸脫氨酶在0.1mm?dctp條件下，酶活為230μmol/mg/min，該酶的表達(dá)量尚可，因此本發(fā)明以該來源的酶為野生酶進(jìn)行改造。

2、現(xiàn)有技術(shù)中脫氧胞苷酸脫氨酶存在的缺陷是：

3、1、專利文件cn110819604b公開了脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用，該脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶突變體未引入多個(gè)突變位點(diǎn)優(yōu)化脫氧胞苷酸脫氨酶的催化性能，無法實(shí)現(xiàn)dcmp的高效轉(zhuǎn)化導(dǎo)致脫氧胞苷酸脫氨酶在dcmp脫氨反應(yīng)中的活性低。

4、2、專利文件cn118480521a公開了一種高酶活的過氧化氫酶突變體及其應(yīng)用，該過氧化氫酶突變體未對(duì)酶的氨基酸序列和反應(yīng)梯度進(jìn)行優(yōu)化，不能對(duì)酶催化性能進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，不利于提高酶的催化活性和反應(yīng)速率，整個(gè)生物催化過程的效率低。

5、3、專利文件cn116287277b公開了胞苷脫氨酶活性的生物標(biāo)記物及其應(yīng)用，該生物標(biāo)記物不能使不同基因片段插入和克隆，不允許使用不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切割，無法根據(jù)需要選擇特定的酶進(jìn)行切割以適應(yīng)不同的基因片段和實(shí)驗(yàn)需求。

6、4、專利文件cn106978405b公開了天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶突變體及其應(yīng)用，該氨酸脫氫酶突變體不能實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主菌中的穩(wěn)定表達(dá)，不便于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過親和層析等方法純化重組蛋白，純化后的酶純度低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體及其應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，包括如下步驟：一、脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成；二、優(yōu)勢(shì)突變體篩選：三、脫氧胞苷酸脫氨酶及突變體純化；四、酶比酶活測(cè)定；

3、所述脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成步驟如下：

4、步驟(1)：獲取streptococcusmutans來源的脫氧胞苷酸脫氨酶的核苷酸序列，該序列在genbank的編號(hào)為vef17940.1；

5、步驟(2)：對(duì)所述核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；

6、步驟(3)：將優(yōu)化后的核苷酸序列進(jìn)行基因合成，并克隆至pet28a載體上，得到重組質(zhì)粒；

7、其中，所述突變體包括n45s、g46s、g46t、i67n、i67t、t69s、v70n、v70s和v70t中的至少一種。

8、優(yōu)選的，所述脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成步驟還包括將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.coli?bl21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以獲得含脫氧胞苷酸脫氨酶母本及其突變體的濕菌體。

9、優(yōu)選的，所述優(yōu)勢(shì)突變體篩選步驟如下：

10、步驟(1)：獲得含脫氧胞苷酸脫氨酶母本及其突變體的濕菌體；

11、步驟(2)：將濕菌體破碎，得到粗酶液；

12、步驟(3)：以脫氧胞苷酸為底物，脫氧胞苷三磷酸為輔底物，使用粗酶液進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn)；

13、步驟(4)：通過hplc檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，以產(chǎn)物相對(duì)含量為指標(biāo)，篩選具有提高催化性能的突變體。

14、優(yōu)選的，所述提高催化性能的突變體包括單點(diǎn)突變i67t和t69s。

15、優(yōu)選的，所述脫氧胞苷酸脫氨酶及突變體純化步驟如下：

16、步驟(1)：將含脫氧胞苷酸脫氨酶母本及其突變體的濕菌體用緩沖液懸浮，進(jìn)行超聲破碎，離心取上清；

17、步驟(2)：使用ni親和柱純化蛋白，收集目的蛋白；

18、步驟(3)：將目的蛋白置于緩沖液中透析，獲得純化后的脫氧胞苷酸脫氨酶及其突變體。

19、優(yōu)選的，所述緩沖液包括ph?8.0的20mm?tris緩沖液，含有0.5m?nacl和20mm咪唑的用于懸浮和沖洗雜蛋白的緩沖液a，以及含有0.5m?nacl和400mm咪唑的用于洗脫目的蛋白的緩沖液b。

20、優(yōu)選的，所述酶比酶活測(cè)定步驟如下：

21、步驟(1)：在40℃、ph?7.0條件下，使用適量酶液、50mm?dcmp、1mm?dctp和0.3mtris-hcl緩沖液進(jìn)行催化反應(yīng)30分鐘；

22、步驟(2)：通過hplc檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，計(jì)算每分鐘生成1μmol的dump所需要的酶量，定義為一個(gè)單位酶活(u)；

23、步驟(3)：測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算每毫克酶蛋白所具有的活力單位數(shù)，即比酶活(u/mg)。

24、一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體在生物酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述脫氧胞苷酸脫氨酶在催化脫氧胞苷酸(dcmp)轉(zhuǎn)化為脫氧尿苷酸(dump)的反應(yīng)中的應(yīng)用，不同反應(yīng)條件，如鎂離子濃度、dctp濃度、底物濃度和酶量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

26、1、本發(fā)明通過定點(diǎn)突變技術(shù)引入多個(gè)突變位點(diǎn)優(yōu)化脫氧胞苷酸脫氨酶的催化性能，在酶的特定位置引入所需的突變從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酶催化性能的精準(zhǔn)調(diào)控，使得優(yōu)化過程更加高效和可控，引入多個(gè)有利突變顯著提高酶的催化活性和反應(yīng)速率，進(jìn)而提升整個(gè)生物催化過程的效率，定點(diǎn)突變技術(shù)增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性等使其能夠在更廣泛的條件下保持催化活性，優(yōu)化酶的氨基酸序列可以使其更好地適應(yīng)特定的底物或反應(yīng)條件，從而拓寬酶的應(yīng)用范圍，優(yōu)化dctp濃度梯度、鎂離子濃度梯度、反應(yīng)溫度梯度和反應(yīng)時(shí)間梯度實(shí)現(xiàn)了dcmp的高效轉(zhuǎn)化，對(duì)于工業(yè)應(yīng)用中的酶催化過程尤為重要，可以顯著降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率，提高了脫氧胞苷酸脫氨酶在dcmp脫氨反應(yīng)中的活性。

27、2、本發(fā)明通過密碼子優(yōu)化提高了脫氧胞苷酸脫氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)效率，確保了重組蛋白的高產(chǎn)量，pet28a載體上的多克隆位點(diǎn)便于不同基因片段的插入和克隆，允許使用不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切割，從而提供多種選擇進(jìn)行基因片段的連接和克隆，根據(jù)需要選擇特定的酶進(jìn)行切割以適應(yīng)不同的基因片段和實(shí)驗(yàn)需求，pet28a載體作為大腸桿菌中的高效表達(dá)載體使得目的基因能夠在宿主菌中穩(wěn)定表達(dá)，pet28a載體包含的特定蛋白標(biāo)簽便于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過親和層析等方法純化重組蛋白，提高了純化后的酶純度。

技術(shù)特征：

1.一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于，包括如下步驟：一、脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成；二、優(yōu)勢(shì)突變體篩選：三、脫氧胞苷酸脫氨酶及突變體純化；四、酶比酶活測(cè)定；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成步驟還包括將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colibl21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以獲得含脫氧胞苷酸脫氨酶母本及其突變體的濕菌體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述優(yōu)勢(shì)突變體篩選步驟如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述提高催化性能的突變體包括單點(diǎn)突變i67t和t69s。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述脫氧胞苷酸脫氨酶及突變體純化步驟如下：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述緩沖液包括ph?8.0的20mm?tris緩沖液，含有0.5m?nacl和20mm咪唑的用于懸浮和沖洗雜蛋白的緩沖液a，以及含有0.5m?nacl和400mm咪唑的用于洗脫目的蛋白的緩沖液b。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體，其特征在于：所述酶比酶活測(cè)定步驟如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)所述的一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體在生物酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用，其特征在于：所述脫氧胞苷酸脫氨酶在催化脫氧胞苷酸(dcmp)轉(zhuǎn)化為脫氧尿苷酸(dump)的反應(yīng)中的應(yīng)用，不同反應(yīng)條件，如鎂離子濃度、dctp濃度、底物濃度和酶量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種高活力的脫氧胞苷酸脫氨酶突變體的制備方法，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟：一、脫氧胞苷酸脫氨酶母本及突變體基因合成；二、優(yōu)勢(shì)突變體篩選：三、脫氧胞苷酸脫氨酶及突變體純化；四、酶比酶活測(cè)定。本發(fā)明通過定點(diǎn)突變技術(shù)引入多個(gè)突變位點(diǎn)優(yōu)化脫氧胞苷酸脫氨酶的催化性能，在酶的特定位置引入所需的突變從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酶催化性能的精準(zhǔn)調(diào)控，顯著提高酶的催化活性和反應(yīng)速率，進(jìn)而提升整個(gè)生物催化過程的效率，定點(diǎn)突變技術(shù)增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等使其能夠在更廣泛的條件下保持催化活性，優(yōu)化酶的氨基酸序列可以使其更好地適應(yīng)特定的底物或反應(yīng)條件，提高了脫氧胞苷酸脫氨酶在dCMP脫氨反應(yīng)中的活性。

技術(shù)研發(fā)人員：李曉燕,劉勝超,亢峰斌,洪健,王宏,張燕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：杭州美亞藥業(yè)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9