本發(fā)明涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、nk細(xì)胞，也稱為自然殺傷細(xì)胞，屬于粒狀淋巴細(xì)胞的一種，是人體免疫系統(tǒng)不可或缺的一部分。在抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。nk細(xì)胞不僅能夠識(shí)別并消滅異常細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞和受病毒感染的細(xì)胞)，而且在某些情況下，它們還參與到過(guò)敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展中。

2、目前，nk細(xì)胞的體外增殖主要通過(guò)兩種方法實(shí)現(xiàn)：一種是feeder法滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，另一種是純因子刺激。滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)通常采用基因修飾的滋養(yǎng)層細(xì)胞，這些細(xì)胞表面表達(dá)有刺激分子和膜結(jié)合細(xì)胞因子。這些細(xì)胞經(jīng)過(guò)輻照滅活后，與nk細(xì)胞共培養(yǎng)，從而激活并促進(jìn)nk細(xì)胞的增殖。純因子法則是在培養(yǎng)nk時(shí)添加多種生物因子對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行刺激從而達(dá)到使nk細(xì)胞擴(kuò)增的目的。然而，滋養(yǎng)細(xì)胞即使經(jīng)過(guò)滅活處理，仍然存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。與滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)相比，純因子培養(yǎng)的nk細(xì)胞在活性和純度上通常表現(xiàn)不佳。

3、因此，開發(fā)一種既能高效促進(jìn)nk細(xì)胞增殖，又能保持高細(xì)胞純度的方法，是目前免疫學(xué)研究領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述問(wèn)題，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于提供一種高活性、高純度，且安全、高效的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

4、第0天，首先，將1.0×107～8.0×107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞接種于盛有27ml?nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液的包被培養(yǎng)瓶中；隨后加入3ml自體血漿和1.0×108～5.0×108個(gè)顆粒/ml?hek293細(xì)胞的外泌體；最后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱；

5、第3天，往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充添加體積比為9:1的nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液和自體血漿；

6、第5天，往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充添加體積比為19:1的nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液和自體血漿；

7、第7天，將細(xì)胞及培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋，補(bǔ)充加入體積比為99:1的nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液和自體血漿以及0.5×108～2.0×108個(gè)顆粒/ml?hek293細(xì)胞的外泌體；

8、第9天至第13天，每隔兩天換液一次，補(bǔ)充新鮮的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液,并維持細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/ml；

9、第14天，停止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，500g離心10min，去上清液，用pbs洗滌多次細(xì)胞沉淀，獲得nk細(xì)胞。

10、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液包括kbm581培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中含有終濃度100～2000iu/ml的il-15和終濃度500～2000i?u/ml的il-2；所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液包括kbm581培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中含有終濃度500～2000iu/ml的i?l-2。

11、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述hek293細(xì)胞的外泌體采用如下步驟獲得：

12、將hek293細(xì)胞過(guò)表達(dá)mil-21及4-1bbl，得到mil-21及4-1bbl基因修飾的hek293細(xì)胞；

13、用hek293無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)基因修飾的hek293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)2～3天，獲得擴(kuò)增細(xì)胞；

14、將擴(kuò)增細(xì)胞接種到盛有hek293無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2天后500g離心10min細(xì)胞，收集上清液，獲得hek293細(xì)胞的第一外泌體原液；同時(shí)收集細(xì)胞沉淀；

15、往收集的細(xì)胞沉淀中加入與所述培養(yǎng)瓶中盛有的hek293無(wú)血清培養(yǎng)基等體積的hek293無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后500g離心10min細(xì)胞，再次收集上清，獲得hek293細(xì)胞的第二外泌體原液；

16、用peg6000溶液對(duì)獲得的第一外泌體原液和第二外泌體原液的混合溶液純化處理，得到hek293細(xì)胞的外泌體。

17、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，mil-21及4-1bbl基因修飾過(guò)的hek293細(xì)胞，采用如下步驟獲得：

18、將細(xì)胞密度為0.5×105～2.0×105個(gè)/ml的hek293細(xì)胞接種到24孔板的每個(gè)孔中，并按照每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞量添加1ml?hek293無(wú)血清培養(yǎng)基，然后放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

19、24h后，取出24孔板，每個(gè)孔中添加100μl～500μl的的hek293無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1h；

20、1h后，按照moi＝1～5，將慢病毒濃縮液加入24孔板的每孔中，繼續(xù)孵育培養(yǎng)6h；

21、6h后，往24孔板的每孔補(bǔ)充700μl?hek293無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h；

22、72h后，往24孔板的每孔中加入終濃度1μg/ml嘌呤霉素，篩選出穩(wěn)定表達(dá)mil-21和4-1bbl的hek293細(xì)胞，獲得mil-21和4-1bbl基因修飾過(guò)的hek293細(xì)胞。

23、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，獲得mil-21及4-1bbl基因修飾的hek293細(xì)胞后，還需對(duì)hek293細(xì)胞作進(jìn)一擴(kuò)大培養(yǎng)處理：

24、用濃度50ng/ml絲裂霉素處理2hmil-21及4-1bbl基因修飾的hek293細(xì)胞，進(jìn)行hek293細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)增后的mil-21和4-1bbl基因修飾的hek293細(xì)胞，備用。

25、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，peg6000溶液對(duì)第一外泌體原液和第二外泌體原液的混合溶液純化處理時(shí)，包括如下步驟：

26、對(duì)收集到的第一外泌體原液和第二外泌體原液混合均勻，將混合溶液按照3000g離心30min，進(jìn)行第一次離心處理；離心結(jié)束后，獲得第一上清液；

27、往第一上清液中加入濃度為8w/w％的peg6000沉析液，且第一上清液與沉析液的體積比為1:2，搖勻后于2～8℃下靜置8h；

28、靜置結(jié)束后，按照13000g離心1h，對(duì)第一上清液與沉析液的混合液進(jìn)行第二次離心處理；離心結(jié)束后，去掉第二上清液，獲得外泌體原液的懸浮液；

29、用濾膜過(guò)濾泌體原液的懸浮液，得到hek293細(xì)胞的外泌體。

30、一實(shí)施例，上述nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，包被培養(yǎng)瓶通過(guò)如下處理得到：

31、往培養(yǎng)瓶中加入50ng/ml的cd16單抗和50ng/ml的cd3單抗，并在4℃冰箱中靜置12h，則得到包被培養(yǎng)瓶。

32、本發(fā)明的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，使用hek293的外泌體替代feeder法培養(yǎng)nk細(xì)胞過(guò)程中加入的滋養(yǎng)層細(xì)胞(即腫瘤細(xì)胞，如，k562細(xì)胞)，減少了因直接使用滋養(yǎng)層細(xì)胞可能帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，hek293外泌體的加入，與nk細(xì)胞表面受體結(jié)合，提供了協(xié)同刺激，激活了nk細(xì)胞并使其高速擴(kuò)增，大大提高了nk細(xì)胞的增殖能力和純度。

技術(shù)特征：

1.一種nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液包括kbm581培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中含有終濃度100～2000iu/ml的il-15和終濃度500～2000iu/ml的il-2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液包括kbm581培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中含有終濃度500～2000iu/ml的il-2。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述hek293細(xì)胞的外泌體采用如下步驟獲得：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述mil-21及4-1bbl基因修飾的hek293細(xì)胞，采用如下步驟獲得：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，篩獲得mil-21及4-1bbl基因修飾的細(xì)胞后，還需對(duì)細(xì)胞作進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)處理：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述peg6000溶液對(duì)第一外泌體原液和第二外泌體原液的混合溶液純化處理時(shí)，包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包被培養(yǎng)瓶通過(guò)如下處理得到：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法,包括步驟：第0天，將單個(gè)核細(xì)胞接種于盛有NK細(xì)胞培養(yǎng)液、自體血漿及HEK293細(xì)胞的外泌體的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14天；培養(yǎng)期間，每個(gè)兩天補(bǔ)加NK細(xì)胞培養(yǎng)液和自體血漿一次，并控制細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/mL；其中，第7天還需補(bǔ)加HEK293細(xì)胞的外泌體；14天培養(yǎng)結(jié)束后，收集離心細(xì)胞，獲得NK細(xì)胞。該培養(yǎng)方法，使用HEK293的外泌體替代feeder法培養(yǎng)NK細(xì)胞過(guò)程中加入的滋養(yǎng)層細(xì)胞，減少了因直接使用滋養(yǎng)層細(xì)胞可能帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，HEK293外泌體的加入，與NK細(xì)胞表面受體結(jié)合，提供了協(xié)同刺激，激活了NK細(xì)胞并使其高速擴(kuò)增，大大提高了NK細(xì)胞的增殖能力和純度。

技術(shù)研發(fā)人員：馬麗雅,江亭,劉東,闞東旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市先康達(dá)生命科學(xué)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9