本發(fā)明屬于仿生類(lèi)腦器官，具體涉及一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法。

背景技術(shù)：

1、人腦作為人體結(jié)構(gòu)及功能最復(fù)雜的器官，既調(diào)節(jié)機(jī)體功能，也是意識(shí)、精神、語(yǔ)言、學(xué)習(xí)、記憶和智能等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。大腦的衰老會(huì)導(dǎo)致阿爾茨海默病(alzheimer's?disease，ad)、帕金森病(parkinson's?disease，pd)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。隨著全球老齡化和我國(guó)老齡化進(jìn)程的不斷加劇，神經(jīng)退行性疾病越來(lái)越危害到人類(lèi)的健康。但大腦結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜程度很大程度上限制了腦科學(xué)的相關(guān)研究，因此建立真實(shí)可靠的腦衰老體外模型對(duì)于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、疾病治療和靶向藥物測(cè)試來(lái)說(shuō)具有一定的難度且需求極大。

2、近幾年來(lái)，類(lèi)腦器官(brain?organoids,bo)相關(guān)研究成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。類(lèi)腦器官能夠形成與人腦類(lèi)似的三維神經(jīng)組織，能夠很好地模擬神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元遷移、皮層分層及神經(jīng)環(huán)路建立等體內(nèi)過(guò)程，衰老的類(lèi)腦器官能夠在一定程度上復(fù)現(xiàn)大腦衰老，但目前相關(guān)模型較少且耗時(shí)較長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)8-9個(gè)月，周期長(zhǎng)且效率低。

3、因此，本發(fā)明提供一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法以解決上述問(wèn)題，該仿生衰老類(lèi)腦器官同時(shí)具有衰老人腦腦部的生理表型及衰老的表型，可用于研究藥物及炎癥刺激等對(duì)衰老腦的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，通過(guò)將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為類(lèi)腦器官，添加博來(lái)霉素，使類(lèi)腦器官具有衰老的特征，可體外模擬衰老人腦腦部情況并進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，包括以下步驟：

4、s1、將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human?induced?pluripotent?stem?cell,hipsc)誘導(dǎo)為擬胚體(embryoid?body,eb)，再將擬胚體eb誘導(dǎo)分化為類(lèi)腦器官(brain?organoid,bo)；

5、s2、將類(lèi)腦器官置于含博來(lái)霉素(bleomycin,blm)的培養(yǎng)基中，制備具有衰老表征的仿生衰老類(lèi)腦器官(aging-bo)。

6、進(jìn)一步的，所述步驟s1中，將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為擬胚體的方法為：培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，當(dāng)匯合密度達(dá)到80％時(shí)，吸去多余培養(yǎng)基，加入胰酶消化后吸去胰酶，加入含y-27632的接種培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞至形成單細(xì)胞混懸液；將單細(xì)胞混懸液加入透明圓底超低吸附微孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到細(xì)胞聚集成圓形的細(xì)胞團(tuán)，即擬胚體。

7、進(jìn)一步的，所述單細(xì)胞混懸液在培養(yǎng)前，先稀釋至濃度為9萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml。

8、進(jìn)一步的，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。

9、進(jìn)一步的，所述步驟s1還包括：在顯微鏡下觀察到細(xì)胞聚集成圓形的細(xì)胞團(tuán)后，每隔兩天加入與單細(xì)胞混懸液體積相同的類(lèi)器官形成培養(yǎng)基，至第5天培養(yǎng)結(jié)束。

10、進(jìn)一步的，所述步驟s1中，將擬胚體誘導(dǎo)分化為類(lèi)腦器官的方法為：將擬胚體加入透明圓底超低吸附微孔板中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的擬胚體用基質(zhì)膠包被，置于培養(yǎng)箱中使基質(zhì)膠固化，再將固化后的含擬胚體的基質(zhì)膠置于透明圓底超低吸附微孔板中，加入擴(kuò)張培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；擴(kuò)張培養(yǎng)完成后，吸去孔板中培養(yǎng)基，再加入成熟培養(yǎng)基，置于水平細(xì)胞搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，得到成熟類(lèi)腦器官。

11、進(jìn)一步的，將擬胚體加入透明圓底超低吸附微孔板中并加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。

12、進(jìn)一步的，所述水平細(xì)胞搖床轉(zhuǎn)速為65rpm；置于水平細(xì)胞搖床上后，每3天更換一次成熟培養(yǎng)基，至第60天培養(yǎng)結(jié)束。

13、進(jìn)一步的，所述步驟s2具體為：在吸除去成熟培養(yǎng)基的成熟類(lèi)腦器官中，加入含博來(lái)霉素的成熟培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到具有衰老表征的仿生衰老類(lèi)腦器官。

14、進(jìn)一步的，所述含博來(lái)霉素的成熟培養(yǎng)基中，博來(lái)霉素的濃度為4μm；培養(yǎng)時(shí)間為14天，每三天更換一次培養(yǎng)基。

15、有益效果

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果：

17、1)本發(fā)明提供的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官制備方法，通過(guò)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞hipsc制備得到類(lèi)腦器官；將博來(lái)霉素加入類(lèi)腦器官的培養(yǎng)基中，14天后類(lèi)腦器官衰老成為誘導(dǎo)衰老類(lèi)腦器官，制備方法簡(jiǎn)單、可靠、成功率高；

18、2)本發(fā)明提供的仿生衰老類(lèi)腦器官，具有人衰老大腦的衰老表型，能夠更好地在體外模擬老年人大腦的情況，能夠用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、疾病治療以及靶向藥物測(cè)試；

19、3)本發(fā)明提供的仿生衰老類(lèi)腦器官，大大縮短了傳統(tǒng)衰老類(lèi)腦器官的培養(yǎng)時(shí)間，使其從8-9個(gè)月降至2.5個(gè)月，能更便捷、快速地研究各種應(yīng)激對(duì)于衰老類(lèi)腦器官的影響。

技術(shù)特征：

1.一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，其特征在于，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種用于模擬老年大腦的仿生衰老類(lèi)腦器官的制備方法，包括以下步驟：將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為擬胚體，再將擬胚體EB誘導(dǎo)分化為類(lèi)腦器官；將類(lèi)腦器官置于含博來(lái)霉素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)類(lèi)腦器官分化出衰老表型，制備具有衰老表征的仿生衰老類(lèi)腦器官，從而模擬人的老年大腦的病生理情況。本發(fā)明提供的衰老類(lèi)腦器官制備方法，大大縮短了類(lèi)腦器官在自然狀態(tài)下達(dá)到衰老所需的時(shí)間，且制備方法簡(jiǎn)便易行，可以更加真實(shí)地模擬人老年大腦的病生理情況，并進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究、疾病造模和藥物篩選，具有傳統(tǒng)體外培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無(wú)法具備的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用前景廣泛。

技術(shù)研發(fā)人員：李正遷,牛夢(mèng)瑩,謝正偉,郭向陽(yáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京大學(xué)第三醫(yī)院（北京大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9