本發(fā)明屬于dna檢測(cè)，具體涉及一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法、引物組及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus,rsv)是一種主要影響兒童和老年人的病毒，常引起嚴(yán)重的下呼吸道感染，如支氣管炎和肺炎。每年，全球有數(shù)百萬(wàn)兒童受到rsv感染，導(dǎo)致大量住院和死亡病例。rsv的基因組是單鏈負(fù)義rna，長(zhǎng)度約為15,000個(gè)核苷酸，包含十個(gè)基因，編碼十一種蛋白質(zhì)。由于rsv的高傳播性和嚴(yán)重的健康影響，研究其基因組結(jié)構(gòu)和變異性對(duì)于控制和預(yù)防rsv感染至關(guān)重要。

2、近年來(lái)，全基因組測(cè)序技術(shù)取得了顯著進(jìn)展，使得對(duì)rsv等病毒的基因組進(jìn)行詳細(xì)解析成為可能。第二代高通量測(cè)序(next-generation?sequencing,ngs)已廣泛應(yīng)用于rsv基因組的研究，能夠提供高覆蓋度和高準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)。盡管ngs技術(shù)在呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序中顯示出許多優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些挑戰(zhàn)。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性依賴(lài)于樣本制備和數(shù)據(jù)處理過(guò)程中的多種因素。為了提高測(cè)序的準(zhǔn)確性，研究人員通常需要進(jìn)行高覆蓋度的測(cè)序，并結(jié)合生物信息學(xué)工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和后續(xù)分析。然而，由于rsv基因組的高變異性和復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)，第二代測(cè)序技術(shù)在拼接完整基因組時(shí)可能遇到挑戰(zhàn)。為了解決這些問(wèn)題，研究人員開(kāi)始探索第三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)。

3、對(duì)于呼吸道合胞病毒的全基因組檢測(cè)，目前通用的方法是采用二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組的測(cè)序，該平臺(tái)存在測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)序讀長(zhǎng)短，測(cè)序結(jié)果存在大量人源基因組dna污染、測(cè)序數(shù)據(jù)量高且測(cè)序結(jié)果較難獲得覆蓋整個(gè)全基因組的序列的問(wèn)題。

4、隨著第三代測(cè)序技術(shù)(如pacbio?smrt和oxford?nanopore)的興起，呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的準(zhǔn)確性和效率得到了進(jìn)一步提升。三代測(cè)序技術(shù)能夠讀取更長(zhǎng)的dna片段，減少了序列組裝的復(fù)雜度，并且在檢測(cè)基因組結(jié)構(gòu)變異方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

5、現(xiàn)有技術(shù)cn116200537a報(bào)道采用三代測(cè)序技術(shù)對(duì)呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒a型檢測(cè)，覆蓋度均為100％，平均測(cè)序深度為1073.26x至4796.85x。然而，該現(xiàn)有技術(shù)存在如下不足和缺陷：其需要非常高的測(cè)序數(shù)據(jù)量、各區(qū)域測(cè)序數(shù)據(jù)分布非常不均一，豐度相差極大、存在多段測(cè)序深度為0或低于20x覆蓋深度的區(qū)域、僅覆蓋合胞病毒a型，無(wú)法對(duì)合胞病毒b型通用、對(duì)樣本要求依賴(lài)性強(qiáng)，ct值25或32的樣本存在區(qū)域缺失等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的測(cè)序數(shù)據(jù)分布不均一等缺陷和不足，本發(fā)明提供一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法、引物及其試劑盒。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法，其包括如下步驟：

4、s1.采用表1的seq?id?no.1～seq?id?no.35所示序列的第一輪擴(kuò)增引物以呼吸道合胞病毒cdna為模板進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；

5、s2.采用表2的seq?id?no.36～seq?id?no.227所示序列的第二輪擴(kuò)增引物以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

6、2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法，其特征在于，還包括如下步驟：s3.測(cè)序接頭連接。

7、所述的一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法，還包括如下步驟：s4.上機(jī)測(cè)序。

8、s1之前還需進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；所述逆轉(zhuǎn)錄的體系包括：2.5pg～5ng/μl核酸、500mmkcl、100mm?tris?hcl、250mm?mgcl2、10mm?dntp、10u/μl逆轉(zhuǎn)錄酶、80nm隨機(jī)引物、10um合胞病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和水；

9、優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件包括：37℃20min，85℃5s；

10、優(yōu)選地，所述合胞病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物具有如seq?id?no.228和seq?id?no.229所示的序列；

11、優(yōu)選地，所述第一輪擴(kuò)增的體系包括：2.5pg～5ng/μl模板、500mm?kcl、100mmtris?hcl、250mm?mgcl2、10mm?dntp、5u/μl?taq聚合酶、10μm第一輪擴(kuò)增引物和水；

12、優(yōu)選地，所述模板指：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

13、優(yōu)選地，所述第一輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：95℃3min；以98℃20s、60℃2min、65℃3min為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；

14、優(yōu)選地，所述第二輪擴(kuò)增的體系包括：0.0025～0.5μl/μl第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物、500mmkcl、100mm?tris?hcl、250mm?mgcl2、10mm?dntp、5u/μl?taq聚合酶、10um第二輪擴(kuò)增引物和水；

15、優(yōu)選地，所述第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：95℃2min；以98℃20s、60℃1min、65℃2min為一個(gè)循環(huán)，共6個(gè)循環(huán)；72℃5min；

16、優(yōu)選地，所述第二輪引物的5’端具有磷酸化修飾。

17、所述測(cè)序接頭連接包括：磁珠純化后進(jìn)行連接反應(yīng)；

18、優(yōu)選地，所述連接反應(yīng)的體系包括：1-10ng/μl二輪擴(kuò)增產(chǎn)物、50mm?mgcl2、5mmatp、50mm?dtt、250mm?tris-hcl、400u/μl?t4連接酶、0.03μl/μl測(cè)序接頭；

19、優(yōu)選地，所述連接反應(yīng)的條件為25℃10min。

20、所述上機(jī)測(cè)序指：將連接產(chǎn)物置于nanopore測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)反應(yīng)。

21、一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的引物組，其包括第一輪擴(kuò)增引物和第二輪擴(kuò)增引物；所述第一輪擴(kuò)增引物具有seq?id?no.1～seq?id?no.93所示序列；所述第二輪擴(kuò)增引物具有seq?id?no.94～seq?id?no.285所示序列。

22、所述第二輪引物的5’端具有磷酸化修飾。

23、一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的試劑盒，其包括所述的一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的引物組。

24、所述一種用于呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的試劑盒，還包括：擴(kuò)增試劑、連接試劑；

25、優(yōu)選地，擴(kuò)增試劑包括：kcl、tris?hcl、mgcl2、dntp、taq聚合酶、水；

26、優(yōu)選地，連接試劑包括：純化磁珠、mgcl2、atp、dtt、tris-hcl、t4連接酶、測(cè)序接頭。

27、本發(fā)明的有益效果如下：

28、本發(fā)明基于第三代測(cè)序技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一套呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序的方法、引物組及其試劑盒，使得呼吸道合胞病毒基因組的全景圖更展示更加清晰完整。本發(fā)明提供的一套針對(duì)呼吸道合胞病毒i型和ii型的長(zhǎng)片段多重?cái)U(kuò)增靶向富集引物，并配套多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和標(biāo)簽序列添加體系，可以在10小時(shí)內(nèi)完成呼吸道合胞病毒的全基因組測(cè)序并實(shí)現(xiàn)病毒的全覆蓋組裝、溯源與分型，可以有效的從臨床樣本中富集出呼吸道合胞病毒的全基因組序列，可以有效解決呼吸道合胞病毒的分型與溯源問(wèn)題。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有如下幾方面的優(yōu)勢(shì)：

29、1、一種基于各呼吸道合胞病毒型別的通用呼吸道合胞病毒全基因組特異性靶向引物設(shè)計(jì)方法及基于該方法開(kāi)發(fā)的呼吸道合胞病毒全基因組測(cè)序試劑盒，在10小時(shí)即可完成呼吸道合胞病毒全基因組的檢測(cè)；

30、2、基于該方法設(shè)計(jì)的多重引物在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣本提取無(wú)需進(jìn)行人源基因組dna的去除，使用常規(guī)的磁珠法等自動(dòng)化儀器提取的dna和rna即可以滿(mǎn)足后續(xù)建庫(kù)測(cè)序的要求；

31、3、該方法具有極高的靈敏度，可以適用于呼吸道合胞病毒ct值高至35的臨床樣本的全基因組的測(cè)序；

32、4、在擴(kuò)增時(shí)通過(guò)第一輪的低濃度特異性引物的多重?cái)U(kuò)增，將通用序列添加至擴(kuò)增的靶標(biāo)條帶上，在直接加入通用的barcode引物與普通的快速擴(kuò)增酶擴(kuò)增，即可以快速完成呼吸道合胞病毒全基因組的文庫(kù)構(gòu)建；

33、5、在使用的barcode?5‘末端額外的添加了磷酸化修飾，在擴(kuò)增時(shí)使用的快速擴(kuò)增酶會(huì)額外的在延伸末端添加a，由此產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測(cè)序接頭的ta連接，極大的簡(jiǎn)化了建庫(kù)步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；

34、6、通過(guò)使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)的三代測(cè)序測(cè)序平臺(tái)，擴(kuò)增的長(zhǎng)片段數(shù)據(jù)僅需簡(jiǎn)單拼接，就可以獲得呼吸道合胞病毒的全基因組序列，可以極大的提高呼吸道合胞病毒型別判定的穩(wěn)定性；

35、7、通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄體系中，添加呼吸道合胞病毒的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，能夠有效提高合胞病毒在3’末端區(qū)域的完整性；

36、8、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)的測(cè)序方法，設(shè)計(jì)的引物為呼吸道合胞病毒的通用性引物，采用一套引物即可完成呼吸道合胞病毒i型和ii型的測(cè)序，而文獻(xiàn)中的方法是針對(duì)不同型別需要使用多套引物；

37、9、本發(fā)明設(shè)計(jì)的通用引物擴(kuò)增片段大小平均在800bp左右，兼顧了所有片段的擴(kuò)增性能，能夠很好的保持?jǐn)U增片段覆蓋的均勻性，而文獻(xiàn)中的方法擴(kuò)增片段最大達(dá)到了4kb，擴(kuò)增非常困難，無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的全基因組富集。本發(fā)明的方法覆蓋范圍廣，可以適配所有的呼吸道合胞病毒型別，均可進(jìn)行全基因組測(cè)序。

38、本發(fā)明的方法適用于常規(guī)的拭子、肺泡灌洗液等多種臨床樣本類(lèi)型，樣本在提取時(shí)無(wú)需進(jìn)行人源基因組dna的去除，使用常規(guī)的磁珠法等自動(dòng)化儀器提取的dna即可以滿(mǎn)足后續(xù)建庫(kù)測(cè)序的要求。

39、本發(fā)明的方法對(duì)多重?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，當(dāng)原始核酸樣本中呼吸道合胞病毒的ct值達(dá)到35時(shí)，仍能夠進(jìn)行全基因組測(cè)序，是一種超高靈敏的基因組測(cè)序方法。

40、本發(fā)明通過(guò)對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物，并在引物5’端加上通用序列，可以實(shí)現(xiàn)在擴(kuò)增富集呼吸道合胞病毒的同時(shí)，將通用序列添加至擴(kuò)增的靶標(biāo)條帶上，在直接加入通用的barcode引物與普通的快速擴(kuò)增酶擴(kuò)增，即可以獲得用于測(cè)序的文庫(kù)。

41、本發(fā)明對(duì)多重?cái)U(kuò)增體系條件進(jìn)行多倫的優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后的擴(kuò)增引物在不進(jìn)行人源基因組dna去除的情況下，測(cè)序數(shù)據(jù)中呼吸道合胞病毒的數(shù)據(jù)占比就可以達(dá)到80％以上，解決了呼吸道合胞病毒全基因組檢測(cè)中人源基因組dna污染的難題。

42、本發(fā)明通過(guò)使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)的三代測(cè)序平臺(tái)，擴(kuò)增的長(zhǎng)片段數(shù)據(jù)僅需要簡(jiǎn)單的拼接，直接就可以獲得全基因組數(shù)據(jù)，本方法測(cè)序的數(shù)據(jù)平均長(zhǎng)度在0.8kb，相比二代平臺(tái)的短讀長(zhǎng)，可以極大的提高呼吸道合胞病毒覆蓋的均一性。