本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及高純度環(huán)狀rna的制備方法。

背景技術(shù)：

1、工程化環(huán)狀rna(circular?rna，circrna)是一類新興的rna分子，具有不同于線性mrna的分子形式，其首尾通過(guò)3’-5’磷酸二酯鍵相連，形成環(huán)狀。由于其分子沒(méi)有自由羥基暴露，所以相較于線性rna分子，環(huán)狀rna在細(xì)胞內(nèi)具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。環(huán)狀rna分子序列中如果包含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入元件(internal?ribosome?entry?site，ires)和編碼區(qū)(coding?sequence，cds)，就可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高效的表達(dá)目的蛋白質(zhì)，因此環(huán)狀rna被認(rèn)為是一個(gè)新興的rna藥物分子。

2、環(huán)狀rna的制備具有多種方法，如化學(xué)法合成、核酸連接酶合成以及核酶自剪接合成。目前應(yīng)用最多的是利用i型或者ii型內(nèi)含子，設(shè)計(jì)成permuted?introns?and?exons(pie)結(jié)構(gòu)，利用內(nèi)含子的核酶活性，自剪接獲得環(huán)狀rna。該方法的環(huán)狀rna制備過(guò)程與傳統(tǒng)線狀mrna相似，首先在t7啟動(dòng)子的下游設(shè)計(jì)環(huán)狀rna的模板序列，一般需要包含1組內(nèi)含子片段，其包含3'剪接位點(diǎn)二核苷酸，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)、5’和3’同源臂、5’和3’端的utr序列和蛋白質(zhì)編碼序列。然后通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(ivt)過(guò)程，獲得環(huán)狀rna的前體，在體系中添加gtp，并將反應(yīng)溫度提升到55℃下進(jìn)行rna環(huán)化，獲得環(huán)狀rna。

3、但是，獲得的環(huán)狀rna是一個(gè)混合物，其中包括多種線狀rna雜質(zhì)，如短的dsrna、未環(huán)化的前體rna、切割下來(lái)的內(nèi)含子rna、具有缺口的環(huán)狀rna(nicked?cirrna)以及其他切割錯(cuò)誤的rna。這些雜質(zhì)必需通過(guò)額外的純化步驟進(jìn)行去除，才能得到純凈的環(huán)狀rna用于生物醫(yī)藥。

4、目前已經(jīng)有多種方案應(yīng)用于環(huán)狀rna的純化。比如，dsrna的去除可以在ivt步驟直接消除其產(chǎn)生，其方法主要有在ivt體系中添加尿素或離液鹽、升高ivt反應(yīng)溫度或者直接利用無(wú)dsrna的t7?rna聚合酶。對(duì)于其他雜質(zhì)目前也有多種方法進(jìn)行去除。

5、利用rnase?r降解線狀rna是一個(gè)常用且簡(jiǎn)便的方法，但是rnase?r降解線狀rna的同時(shí)，常常也可以將部分環(huán)狀rna降解掉，因此該方法需要摸索酶與rna的配比以及反應(yīng)時(shí)間；另外，由于設(shè)計(jì)的工程化環(huán)狀rna序列中，常常包含有特殊結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止rnase?r對(duì)線狀rna的降解，因此該方法并不能得到高純的環(huán)狀rna。

6、利用分子排阻層析(sec)方法純化環(huán)狀rna也是目前大量制備環(huán)狀rna的常用方法；該方法必需利用孔徑很大的層析填料，如賽分科技的srt-sec-1000層析填料已經(jīng)被廣泛利用。該方法的在分離分子量差別較大的雜質(zhì)時(shí)可以有很好的表現(xiàn)，比如內(nèi)含子的去除；但是在分離分子量差別很小的分子時(shí)，表現(xiàn)很差，比如具有缺口的環(huán)狀rna，該雜質(zhì)分子與目標(biāo)環(huán)狀rna序列相同，分子量相同，其產(chǎn)率非常低。而且該方法的上樣量有限，因此該方法很難應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)。

7、相對(duì)于分子排阻法，利用反相高效液相色譜(rp-hplc)法進(jìn)行環(huán)狀rna純化具有一定的優(yōu)勢(shì)，如分辨率有所提高，上樣量較大可以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，但是依然不能很好的分離nicked?rna、產(chǎn)率較低。而且該方法用到了有毒的有機(jī)試劑，其產(chǎn)品很難應(yīng)用到生物醫(yī)藥方面。

8、因此無(wú)法得到高純度的環(huán)狀rna嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，一些實(shí)施例公開了高純度環(huán)狀rna的制備方法，包括步驟：

2、s1、構(gòu)建具有自剪接活性的環(huán)化骨架序列；環(huán)化骨架序列從5’端至3’端包含以下模塊化元件：t7啟動(dòng)子、5’末端同源片段、3’內(nèi)含子-外顯子片段、5’內(nèi)部同源片段、5’端間隔序列、ires序列、目標(biāo)片段、3’端間隔序列、3’內(nèi)部同源片段、外顯子片段-5’內(nèi)含子、3’末端同源片段、xba?i內(nèi)切酶切位點(diǎn)；

3、s2、將環(huán)化骨架序列插入puc57載體中，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；

4、s3、提取質(zhì)粒，利用xba?i內(nèi)切酶線性化載體，獲得體外擴(kuò)增模版；

5、s4、使用無(wú)dsrna的t7rna聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增反應(yīng)，獲取無(wú)dsrna的前體rna；

6、s5、前體rna進(jìn)行環(huán)化，得到粗制環(huán)狀rna原液；粗制環(huán)狀rna原液中包含有環(huán)狀rna和線性rna；

7、s6、利用poly(a)或poly(u)聚合酶處理粗制環(huán)狀rna原液，對(duì)其中的線性rna增加poly(a)或poly(u)長(zhǎng)尾；

8、s7、利用親和層析柱對(duì)粗制環(huán)化rna原液進(jìn)行純化，將增加有poly(a)或poly(u)長(zhǎng)尾的線性rna與環(huán)狀rna相分離，得到高純環(huán)狀rna；親和層析柱的親和層填料的結(jié)合基團(tuán)包括oligo(dt)、oligo(du)、oligo(da)、oligo(dat)、oligo(dct)、oligo(dgt)、oligo(dac)、oligo(dag)、oligo(dau)、oligo(dcu)或oligo(dgu)。

9、本發(fā)明實(shí)施例公開的高純度環(huán)狀rna的制備方法，將雜質(zhì)線性rna的端部增加了poly(a)或poly(u)長(zhǎng)尾，利用親和層析柱將環(huán)狀rna與線性rna有效分離，得到了高純度的環(huán)狀rna。

技術(shù)特征：

1.高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，包括步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，步驟s4包括：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，步驟s5包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，步驟s6包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，步驟s1中，所述環(huán)化骨架序列的5’端間隔序列和3’端間隔序列包含有poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)中一個(gè)或多個(gè)序列的組合；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，步驟s1中，所述環(huán)化骨架序列的5’端間隔序列和3’端間隔序列不包含有poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)；

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液包含有0.5～1.5m的nacl或者0.25～1m的licl。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，所述親和層析柱的親和層填料基質(zhì)為瓊脂糖、葡聚糖、sio2或者其他高分子凝膠；結(jié)合基團(tuán)的長(zhǎng)度為18～30bp。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，環(huán)化骨架序列中的poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)序列的長(zhǎng)度為10～60bp。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高純度環(huán)狀rna的制備方法，其特征在于，線性rna的末端增加的poly(a)或poly(u)長(zhǎng)尾的長(zhǎng)度，是環(huán)化骨架序列中poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)序列長(zhǎng)度的2～10倍。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了高純度環(huán)狀RNA的制備方法，包括步驟：構(gòu)建具有自剪接活性的環(huán)化骨架序列；環(huán)化骨架序列從5’至3’端包含以下模塊化元件：T7啟動(dòng)子、5’末端同源片段、3’內(nèi)含子?外顯子片段、5’內(nèi)部同源片段、5’端間隔序列、IRES序列、目標(biāo)片段、3’端間隔序列、3’內(nèi)部同源片段、外顯子片段?5’內(nèi)含子、3’末端同源片段、Xba?I內(nèi)切酶切位點(diǎn)；將環(huán)化骨架序列插入pUC57載體中，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；利用Xba?I內(nèi)切酶線性化載體，獲得體外擴(kuò)增模版；使用無(wú)dsRNA的T7RNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增反應(yīng)，獲取無(wú)dsRNA的前體RNA；前體RNA進(jìn)行環(huán)化得到粗制環(huán)狀RNA；利用poly(A)或poly(U)聚合酶處理粗制環(huán)狀RNA，對(duì)其中的線性RNA增加poly(A)或poly(U)長(zhǎng)尾；利用親和層析柱純化得到高純環(huán)狀RNA。

技術(shù)研發(fā)人員：梅英武,魏璐璐,張夢(mèng)娟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鄭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6