本發(fā)明屬于生物農(nóng)業(yè)檢測(cè)，具體涉及一種檢測(cè)梨火疫病菌的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、梨火疫病由梨火疫病菌(erwinia?amylovora)引起，梨火疫病菌寄主范圍廣，能侵染危害薔薇科32屬140多種植物，主要侵染梨、蘋果、山楂、海棠和榅桲等薔薇科仁果類植物，對(duì)梨、蘋果等危害非常嚴(yán)重。在梨樹上，發(fā)生梨火疫病的新梢、花朵和果實(shí)在發(fā)病初期有明顯的水漬狀病斑，氣候濕潤(rùn)時(shí)有菌膿滲出，隨著病程加重，發(fā)病組織變黑枯萎，新梢呈龍頭拐狀，葉片、花和病果僵而不落，似火燒狀，最終導(dǎo)致全株枯死。許多國(guó)家因梨火疫病爆發(fā)造成無(wú)法挽回的損失。為防止病害進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延，采用可靠的檢測(cè)方法對(duì)病菌檢測(cè)和疫情監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。

2、已有檢測(cè)技術(shù)中使用最為廣泛的檢測(cè)方法是基于pcr的分子生物學(xué)技術(shù)，包括常規(guī)pcr檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。已有的常規(guī)pcr檢測(cè)擴(kuò)增的dna片段大，不適合用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。已有設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物在使用染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增的dna片段存在特異性低的問(wèn)題，必須結(jié)合熒光探針才能實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)。此外，基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)時(shí)，熒光探針價(jià)格昂貴，增加了檢測(cè)成本，限制了技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性dna片段，不僅同時(shí)適用于梨火疫病菌的常規(guī)pcr檢測(cè)和染料法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，而且還具有檢測(cè)特異性高的特點(diǎn)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性dna片段，所述特異性dna片段的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的引物對(duì)，所述引物對(duì)為擴(kuò)增所述特異性dna片段的引物對(duì)；

5、所述引物對(duì)包括核苷酸序列如seq?id?no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seqid?no:3所示的反向引物。

6、本發(fā)明提供了一種梨火疫病菌的檢測(cè)試劑盒，包括所述引物對(duì)。

7、優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒還包括dna聚合酶、緩沖液和所述特異性dna片段。

8、本發(fā)明提供了一種所述特異性dna片段、所述引物對(duì)或所述檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)作物梨火疫病中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明提供了一種作物病原菌梨火疫病菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

10、1)以待測(cè)樣本的基因組dna為模板，采用所述引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)和/或常規(guī)pcr檢測(cè)；

11、2)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣本是否攜帶梨火疫病菌；

12、實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：若ct值≤35且出現(xiàn)“s”型曲線，則判定樣本攜帶梨火疫病菌；若ct值＞40，則判定樣本不攜帶梨火疫病菌；若35＜ct值≤40，需要重新檢測(cè)；

13、常規(guī)pcr檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為136bp的片段時(shí)，則判定樣本攜帶梨火疫病菌；當(dāng)沒(méi)有擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為136bp的片段時(shí)，則判定樣本不攜帶梨火疫病菌。

14、優(yōu)選的，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的擴(kuò)增體系為：2×taq?pro?universal?sybrqpcr?mastermix?10μl、10μm上下游引物各0.5μl和基因組dna模板100～200ng，用ddh2o補(bǔ)足20μl；

15、所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。

16、優(yōu)選的，所述常規(guī)pcr檢測(cè)的擴(kuò)增體系為：2×taqpcrmastermix?10μl、10μm上下游引物各0.5μl和基因組dna模板100～200ng，用ddh2o補(bǔ)足20μl；

17、所述常規(guī)pcr檢測(cè)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

18、優(yōu)選的，所述待測(cè)樣本包括薔薇科仁果類植物。

19、優(yōu)選的，所述薔薇科仁果類植物包括以下至少一種：梨、蘋果、山楂、海棠和榅桲。

20、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

21、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性dna片段，核苷酸序列如seq?idno:1所示。在本發(fā)明中，所述特異性dna片段的長(zhǎng)度僅為136bp，以所述特異性dna片段為目標(biāo)片段檢測(cè)梨火疫病菌和多種作物致病菌微生物時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，且特異性強(qiáng)，能從多種作物致病菌微生物中準(zhǔn)確區(qū)分出梨火疫病菌。同時(shí)，以所述特異性dna片段為靶標(biāo)鑒定多種寄主作物(梨、蘋果、山楂、海棠和榅桲)時(shí)，不會(huì)擴(kuò)增出非特異性條帶，而以p1和p3～p10為引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)時(shí)，均出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增。此外，通過(guò)對(duì)不同地區(qū)的陽(yáng)性樣本和陰性樣本檢測(cè)，結(jié)果表明以所述特異性dna片段為靶標(biāo)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，常規(guī)pcr和染料法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)準(zhǔn)確性均為100％。可見(jiàn)，本發(fā)明所述特異性dna片段具有片段長(zhǎng)度短、特異性強(qiáng)且準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，同時(shí)適用于梨火疫病菌的常規(guī)pcr檢測(cè)和染料法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。

22、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的引物對(duì)，為擴(kuò)增所述特異性dna片段的引物對(duì)；包括核苷酸序列如seq?id?no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:3所示的反向引物。所述引物對(duì)僅能特異性擴(kuò)增梨火疫病菌，與其他多種作物致病菌和寄主作物(梨、蘋果、山楂、海棠和榅桲)均不發(fā)生交叉反應(yīng)。所述引物對(duì)可用于常規(guī)pcr和染料法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)植物樣本中梨火疫病菌，并且無(wú)須結(jié)合熒光探針也能實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)，相比探針?lè)ǜ庸?jié)省成本，易于推廣應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明引物對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性高，常規(guī)pcr和實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)引物鑒定結(jié)果一致。此外，本發(fā)明引物對(duì)具有靈敏度高的特點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度為0.1cfu/μl。

23、本發(fā)明提供了一種作物病原菌梨火疫病菌的檢測(cè)方法，以待測(cè)樣本的基因組dna為模板，采用所述引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)和/或常規(guī)pcr檢測(cè)；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣本是否攜帶梨火疫病菌。所述方法可用于常規(guī)pcr和染料法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)植物樣本中梨火疫病菌，并且無(wú)須結(jié)合熒光探針也能實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)，相比探針?lè)ǜ庸?jié)省成本。同時(shí)，具有檢測(cè)準(zhǔn)確性高和靈敏度高的特點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性dna片段，其特征在于，所述特異性dna片段的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)為擴(kuò)增權(quán)利要求1所述特異性dna片段的引物對(duì)；

3.一種梨火疫病菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述引物對(duì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒還包括dna聚合酶、緩沖液和權(quán)利要求1所述特異性dna片段。

5.權(quán)利要求1所述特異性dna片段、權(quán)利要求2所述引物對(duì)或權(quán)利要求3或4所述檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)作物梨火疫病中的應(yīng)用。

6.一種作物病原菌梨火疫病菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的擴(kuò)增體系為：2×taqpro?universal?sybr?qpcrmastermix?10μl、10μm上下游引物各0.5μl和基因組dna模板100～200ng，用ddh2o補(bǔ)足20μl；

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述常規(guī)pcr檢測(cè)的擴(kuò)增體系為：2×taqpcrmastermix?10μl、10μm上下游引物各0.5μl和基因組dna模板100～200ng，用ddh2o補(bǔ)足20μl；

9.根據(jù)權(quán)利要求6～8任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本包括薔薇科仁果類植物。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述薔薇科仁果類植物包括以下至少一種：梨、蘋果、山楂、海棠和榅桲。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)梨火疫病菌的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物農(nóng)業(yè)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性DNA片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增所述特異性DNA片段的引物對(duì)，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的反向引物。本發(fā)明所述引物對(duì)可對(duì)梨火疫病菌進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)和/或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，具有特異性高的特點(diǎn)，并且無(wú)須結(jié)合熒光探針也能實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：樓兵干,劉朋飛,陳潤(rùn)麗,湯蘇揚(yáng),張舒涵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2