本發(fā)明涉及分子育種，尤其是涉及水稻氮高效利用基因osnac15、其編碼的蛋白及其應用。

背景技術(shù)：

1、水稻(0ryza?sativa)是人類重要的糧食作物之一，且營養(yǎng)價值豐富，是全世界約一半以上人口的主食。氮肥是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因子。目前，我國在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在著施氮量偏高、利用率低的現(xiàn)象。若氮肥施用量過大，不僅造成糧食減產(chǎn)，而且還會引起水體富營養(yǎng)化等一系列嚴重環(huán)境問題。提高水稻氮素利用效率(nitrogenuseefficiency,nue)已成為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。因此，在水稻栽培中培育氮高效利用新品種，不僅可以實現(xiàn)水稻氮肥的合理利用，也能減輕過量施氮造成的環(huán)境問題，具有潛在的重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價值。

2、氮是一種大量元素，是水稻生長不可或缺的營養(yǎng)元素之一。適量施用氮肥不僅能增加水稻的產(chǎn)量，還能改善稻米的品質(zhì)。水稻利用氮素的過程包括氮吸收、轉(zhuǎn)運、同化和再利用等過程，涉及多個基因、多個途徑的參與和調(diào)控。氮肥在土壤中以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮形式存在，水稻根系可調(diào)控硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收、轉(zhuǎn)運，并通過硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶實現(xiàn)氮同化。在植株地上部分，氮素的運輸和分配受到氮素轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白等的調(diào)控。

3、在水稻氮高效利用中轉(zhuǎn)錄因子扮演著關(guān)鍵角色。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達，它們通過結(jié)合到dna上的特定序列來激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響植物對氮素的吸收、轉(zhuǎn)運、同化和再利用等過程。若提高特定轉(zhuǎn)錄因子的表達水平可以顯著提高水稻的氮素利用效率。例如，snac1可能通過調(diào)節(jié)與氮代謝相關(guān)的基因表達來影響水稻的氮肥利用效率；過表達osenod93-1基因的轉(zhuǎn)基因水稻顯示出更高的產(chǎn)量和生物量，這表明該基因可能在提高水稻氮素利用效率中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控與氮素代謝相關(guān)的基因表達，直接影響水稻的氮素利用效率。由此可見通過研究和利用這些轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控的基因，可以為培育氮高效的水稻新品種提供重要的理論基礎和技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供水稻氮高效利用基因osnac15、其編碼的蛋白及其應用，以為解決全球糧食安全問題與環(huán)境保護挑戰(zhàn)，提供一個與氮高效利用高度連鎖的候選基因。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供過表達osnac15基因在氮高效利用中的作用，osnac15基因的核苷酸序列可以選自1)如seq?id?no.3所示的cds序列；2)在高嚴謹條件下可與seq?id?no.3所示的dna序列雜交的核苷酸序列。

3、osnac15基因編碼的氨基酸序列如(a)seq?id?no.4所示的301個氨基酸殘基組成；(b)將seq?id?no.4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和缺失和/或添加且具有與(a)相同活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；(c)其它基因編碼的與seq?id?no.4所示的氨基酸序列組成的蛋白具有50％以上相似度的氨基酸同一性并且具有與(a)相同活性的蛋白。

4、優(yōu)選地，過表達osnac15基因提高植株苗期根和芽的氮吸收速率。

5、如上所述的過表達osnac15基因在提高作物產(chǎn)量中的應用。

6、包含上述osnac15基因的重組載體在提高作物氮利用率、產(chǎn)量中的應用，所述重組載體為過表達載體。

7、包含上述過表達osnac15基因重組載體的宿主細胞在提高作物氮利用率、產(chǎn)量中的應用，所述宿主細胞為微生物細胞，優(yōu)選為大腸桿菌細胞或農(nóng)桿菌細胞。

8、過表達如上所述的osnac15基因的植株，所述植株通過基因工程手段獲得，包括農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射技術(shù)；或者利用雜交方法得到過表達氮高效利用基因osnac15或其活性片段的后代植株。所述植物包括，但不限于水稻、擬南芥、小麥、玉米、棉花、油菜或大豆，優(yōu)選水稻。

9、如上所述的過表達osnac15基因在作物氮高效利用品種選育中的應用。

10、一種培育氮高效利用率植物的方法，所述方法包括：將上述的基因或其活性片段或重組表達載體導入植物細胞，得到轉(zhuǎn)基因植株，或?qū)鲜龌蚧蚱浠钚云蔚闹仓昱c另一植株雜交。

11、在另一個實施方案中，通過雜交方法在后代植株中導入氮高效利用基因osnac15。例如，將包含編碼seq?id?no.4所示的氨基酸序列的分離的核苷酸序列或其活性片段的植株與另一植株雜交獲得后代植株，篩選出穩(wěn)定純合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的雜交植株，與未雜交的植株相比，所得到的雜交后代植株具有提高的氮利用率。

12、優(yōu)選地，所述方法還包括在導入植物細胞之前將權(quán)利要求1所述的基因針對所述植物的密碼子應用進行密碼子優(yōu)化的步驟。

13、本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解，上述方法還包括在導入植物細胞之前將編碼seq?idno.4所示的氨基酸序列分離的核苷酸序列針對所述植物的密碼子應用進行密碼子優(yōu)化的步驟。

14、本發(fā)明的培育方法可以用于水稻、玉米、小麥、棉花、油菜、大豆、牧草或擬南芥的育種，優(yōu)選用于水稻育種。利用該方法，可以得到具有提高的氮利用率的植物品種。育種的原理即為在植株中過表達osnac15基因，具體而言，可以通過在植株中過表達編碼seq?idno.4所示的氨基酸序列的分離的核苷酸序列或其活性片段而實現(xiàn)。利用所述培育方法得到的轉(zhuǎn)基因植株或雜交后代植株在低氮和/或高氮生長條件下具有生長優(yōu)勢。在本發(fā)明中，正常施氮量一般為150kg氮素/公頃，“低氮生長條件”通常是指施加正常施氮量0.1-0.5倍的氮肥量，“高氮生長條件”通常是指施加正常施氮量1.5-2倍的氮肥量。

15、當用于培育具有提高的氮利用率的水稻時，所述培育方法包括：將編碼seq?idno.4所示的氨基酸序列的分離的核苷酸序列或其活性片段導入水稻細胞，得到轉(zhuǎn)基因水稻細胞，由所述轉(zhuǎn)基因水稻細胞產(chǎn)生表達所述分離的核苷酸序列或其活性片段的轉(zhuǎn)基因水稻植株，與未導入所述分離的核苷酸序列或其活性片段的對照水稻相比，所述轉(zhuǎn)基因水稻具有提高的氮利用率；或者所述方法包括：將包含編碼seq?id?no.4所示的氨基酸序列的分離的核苷酸序列或其活性片段的水稻植株與另一水稻植株雜交獲得后代水稻植株，篩選出穩(wěn)定純合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的雜交植株，與未雜交的水稻植株相比，所得到的雜交后代植株具有提高的氮利用率。

16、總的來說，本發(fā)明所提供的氮高效利用基因來源于水稻，名稱為osnac?15，是下述核苷酸序列之一：

17、1)編碼seq?id?no.4所示的多肽的核苷酸序列；

18、2)seq?id?no.3的dna序列；

19、3)在高嚴謹條件下可與seq?id?no.3限定所示的dna序列雜交的核苷酸序列。

20、seq?id?no.3由906個堿基組成，其編碼序列為自5′端第1位堿基開始，編碼seq?idno.4所示的氨基酸序列。

21、含有本發(fā)明的氮高效利用基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

22、擴增osnac15中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

23、利用植物表達載體，將本發(fā)明的氮高效利用基因?qū)胫参锛毎?，可獲得對氮素利用效率增強的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。

24、所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其他的可參與mrna加工或基因表達的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆儲存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。

25、使用osnac15構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其他的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因

26、為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如除草劑bar基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

27、攜帶有本發(fā)明osnac15的植物表達載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜、棉花等雙子葉植物。

28、通過對轉(zhuǎn)化osnac15基因后所得到的轉(zhuǎn)基因水稻在不同氮水平營養(yǎng)液中生長實驗以及田間實驗，證明該基因在轉(zhuǎn)入植物后可顯著提高植株的氮利用效率，提高植物的生物量；通過對轉(zhuǎn)化osnac15基因后所得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同氮水平培養(yǎng)基中的生長實驗，證明該基因在模式植物中的功能保守。本發(fā)明為人為增強植物氮利用效率提供了基礎，將在培育氮營養(yǎng)高效利用的植物(特別是水稻、玉米、小麥、油菜、大豆、棉花等農(nóng)作物)中發(fā)揮重要的作用。

29、因此，本發(fā)明提供的水稻氮高效利用基因osnac15、其編碼的蛋白及其應用，其具體技術(shù)效果如下：

30、(1)本發(fā)明首次公開osnac15基因在水稻氮高效利用中的作用，過表達水稻osnac15基因顯著提高植株的氮利用率，突變osnac15基因顯著降低植株的氮利用率；

31、(2)過表達水稻osnac15基因顯著提高水稻的結(jié)實率、有效穗數(shù)、單株產(chǎn)量、干重；突變osnac15基因顯著降低水稻的結(jié)實率、有效穗數(shù)、單株產(chǎn)量、干重；

32、(3)突變和/或過表達osnac15基因，植株發(fā)育正常，可以通過精準調(diào)控該基因的表達水平，實現(xiàn)水稻氮素營養(yǎng)利用率的調(diào)控，不僅可以促進水稻產(chǎn)量的增加，還可以有效緩解因氮肥過量施用而引發(fā)的環(huán)境問題，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應用潛力，特別是在培育能夠高效吸收與利用氮肥的作物品種方面，如水稻、玉米、小麥、大豆、棉花及油菜等關(guān)鍵農(nóng)作物，其廣泛應用將有望引領(lǐng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)更加環(huán)保、高效，為解決全球糧食安全問題與環(huán)境保護挑戰(zhàn)提供有力的科技支撐。

33、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。