本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，具體為家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4、克隆方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、家蠶(bombyxmori)的脂肪體，不僅是體內(nèi)分布廣泛且含量顯著的關(guān)鍵組織，也是營(yíng)養(yǎng)與能量的核心儲(chǔ)存庫(kù)。家蠶脂肪體內(nèi)部高效的蛋白質(zhì)合成機(jī)制，特別是在貯藏蛋白、脂蛋白及卵黃原蛋白的生成與釋放方面，展現(xiàn)出高度的性別與發(fā)育階段特異性，這些蛋白質(zhì)以特定模式被釋放并積累于血淋巴中，調(diào)節(jié)家蠶的生理狀態(tài)。鑒于家蠶脂肪體在蛋白質(zhì)合成與調(diào)控中的核心地位，使其成為探索家蠶變態(tài)機(jī)制及基因表達(dá)發(fā)育調(diào)控的理想模型組織。此外，家蠶脂肪體卓越的蛋白質(zhì)合成與儲(chǔ)存能力預(yù)示著其作為新型生物反應(yīng)器的巨大潛力，有望用于生產(chǎn)高價(jià)值的重組蛋白，為生物技術(shù)領(lǐng)域開(kāi)辟新的應(yīng)用路徑。

2、為實(shí)現(xiàn)脂肪體作為生物反應(yīng)器的應(yīng)用，首要任務(wù)是分離并鑒定出特異性的脂肪體啟動(dòng)子，以在特定時(shí)間和空間內(nèi)驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因的高效表達(dá)。雖然有關(guān)家蠶脂肪體及其表達(dá)基因的功能研究較多，但是家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子的鑒定等研究,還較少有涉及。鄧黨軍等人利用piggybac系統(tǒng)成功構(gòu)建了bmlsp、bmlp3等脂肪體全時(shí)期特異表達(dá)載體，為脂肪體生物反應(yīng)器的研究提供了重要參考。

3、近期，通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)一新的家蠶芳基貯藏蛋白基因，該基因在家蠶的脂肪體內(nèi)呈現(xiàn)高量的特異表達(dá)模式。說(shuō)明該基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率，因此依托于轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)外源蛋白在家蠶脂肪體內(nèi)的高效表達(dá)，從而提升家蠶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這一發(fā)現(xiàn)為利用家蠶脂肪體生產(chǎn)外源蛋白提供了新的可能性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問(wèn)題：獲得一種家蠶脂肪體特異表達(dá)的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)外源基因在家蠶脂肪體組織內(nèi)的特異性表達(dá)，從而利用家蠶脂肪體作為生物反應(yīng)器；鑒于此，本發(fā)明提供了家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4、克隆方法及其應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4，所述啟動(dòng)子sp4的核苷酸序列如seqid?no.1所示，其來(lái)源于家蠶bmsk0001308基因。seq?id?no.1序列為：gcttctccggttacgtacaactttcatacgttacaatgtatctgttgttatgtaaaacgataaaagcagtcgtttaaagcactagactgacgcaataattttttatcgatgtctcttttgtattctaattgatcgcaattaattgttctgtttacgcgcaaaaattacattaagtatttatcacaatgttctgtgtagatagaacaagctaacgagttcaatgacttccttgctcatttaggtctaccatgggtactggtttgaggaattgtgttttcaaaatgaacgtttctcctgtcactgttggatgttttaaaaacctggttgaagtgttttttgctggtggtgcgtcgttttgtgagcccgcatgtgtagataccacgaccccgtccatttccgccgcgatgcagcaatgcgttacgctttgaagggaaactctcccgttgtattatataacggagacatggaagtcatgtcttttttttattgcttaaaatgggtggacgagctcacagcccacctggtgttaagtggctactggagcccatagacatttacgacgtaaatgcgccatccaccttgagatataagttctaaggtctcaagtatagttaccacggctgccccacccttcaaactgaaacgcattactgcttcacggcagaaataggcagggtggtggtacccacccgcgcggagtcacaagaggtcctaccaccagtaaaaacatgcatggtgtctaaacatgcatggtttaatagatacatagacataatatagatgttggtaggttcgatgcaccggggtcggtggcagccttcctcagctgctccttcttcttacttcctcttcgctttatttctctacttaccaactactgactaaacataaaactatactaagctaatcactgactagggctatgttataccattattgtattgctcagaatgcaccaaaggtatgacacaaaaagaaactacgactttaatgctaaactaataaacatggtttccgtgcctgggcccaccccatacaataacaattataagttgagctatggtctttttggcactcatccggcctggactctctttacggggc。

3、優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子sp4的特異性擴(kuò)增引物為：上游引物sp4-f，序列為seq?idno.2；下游引物sp4-r，序列為seq?id?no.3。序列具體為：

4、sp4-f(seq?id?no.2)：gcgtcgacgcttctccggttacgtacaact；

5、sp4-r(seq?id?no.3)：cgcggatccgccccgtaaagagagtccag。

6、以上所述的家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4的克隆方法，所述方法包括以下步驟：

7、s1、結(jié)合silkdb3.0數(shù)據(jù)庫(kù)rna-seq表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選獲得家蠶脂肪體內(nèi)高量表達(dá)的bmsk0001308基因；

8、s2、從silkdb3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中截取bmsk0001308基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的片段，利用啟動(dòng)子位置預(yù)測(cè)在線軟件bdgp:neural?network?promoter?prediction(fruitfly.org)進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，在311-361bp處得到score為0.94的核心啟動(dòng)子區(qū)域，依此設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，上游引物為sp4-f、下游引物為sp4-r；得到如seq?id?no.1所示的序列。

9、以上所述的家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4的載體。

10、優(yōu)選的，所述方法包括以下步驟：

11、s3、酶切回收s2的pcr產(chǎn)物，與攜帶目標(biāo)基因的載體連接，構(gòu)建獲得中間載體；用ascⅰ酶切中間載體，經(jīng)電泳分離回收含特異啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的片段；用ascⅰ酶切基礎(chǔ)骨架載體，回收并去磷酸化得到線性骨架載體；隨后將含特異啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的片段與線性骨架載體連接得到重組載體。

12、優(yōu)選的，攜帶目的基因的中間載體為sp4-目標(biāo)基因-sv40-1180，基礎(chǔ)骨架載體為pbac[3×p3-egfp]。

13、以上所述家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4在構(gòu)建家蠶生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。

14、以上所述載體在構(gòu)建家蠶生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。

15、有益效果：(1)本發(fā)明克隆獲得了家蠶脂肪體特異表達(dá)啟動(dòng)子sp4及其轉(zhuǎn)基因重組載體，所述啟動(dòng)子和重組載體均能實(shí)現(xiàn)外源基因在家蠶脂肪體組織中特異性高效表達(dá)；(2)所述啟動(dòng)子及其重組載體具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率，為利用家蠶脂肪體作為生物反應(yīng)器提供了有力工具。