本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種用于藥用植物獨(dú)根草屬、槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的引物組合及鑒定方法。

背景技術(shù)：

1、獨(dú)根草屬(oresitrophe)和槭葉草屬(mukdenia)均為虎耳草科的多年生草本植物，通常生長(zhǎng)在溫帶落葉林中的山崖巖石縫隙間。它們既是觀賞植物，也是中藥的原料。獨(dú)根草屬僅包含一個(gè)物種，獨(dú)根草(oresitrophe?rupifraga)，分布在中國(guó)中部和北部，低海拔至中海拔地區(qū)(590-2050m)。獨(dú)根草具有重要的藥用價(jià)值，其根、莖和葉中均含有粗灰分、粗纖維、粗脂肪、還原糖、部分礦質(zhì)元素及活性成分，可用于治療腎虛、腰膝冷痛、陽(yáng)瘦遺精、神經(jīng)官能癥等。獨(dú)根草在光照不足的室內(nèi)能有效吸收二氧化碳，降低室內(nèi)空氣中的二氧化碳濃度，保障身體健康。槭葉草屬包含兩個(gè)物種，槭葉草(mukdenia?rossii)和巖槭葉草(mukdenia?acanthifolia)。槭葉草分布于中國(guó)東北至朝鮮半島，海拔分布在300-900m，有養(yǎng)心安神的功效，可補(bǔ)心陽(yáng)益心血。巖槭葉草目前僅在遼寧莊河和本溪有發(fā)現(xiàn)，分布在海拔110m左右，根據(jù)文獻(xiàn)記錄朝鮮咸鏡北道也有分布。由于過(guò)度開(kāi)發(fā)和原始棲息地的破碎化，這些植物的野生種群數(shù)量急劇減少，其中槭葉草被列為中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物，巖槭葉草被列為遼寧三級(jí)保護(hù)植物。

2、為了對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬植物資源進(jìn)行合理利用，滿足相關(guān)藥用、觀賞需求，均需要對(duì)這些物種的分類和產(chǎn)地進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確的鑒定。目前，獨(dú)根草屬和槭葉草屬植物只能通過(guò)觀察植株外形進(jìn)行鑒定。由于獨(dú)根草、槭葉草、巖槭葉草在形態(tài)上的高度相似性，特別是非開(kāi)花季節(jié)，鑒定十分困難，經(jīng)常出現(xiàn)誤用和故意摻假的現(xiàn)象。并且運(yùn)用表型鑒定技術(shù)無(wú)法獲取植物的產(chǎn)地信息，因此在運(yùn)用這些植物作為原材料加工的藥品產(chǎn)品時(shí)，無(wú)法確定其道地性。因此需要用分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳層面的比較，以快速鑒別出不同物種和產(chǎn)地。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于藥用植物獨(dú)根草屬、槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的引物組合及鑒定方法。本發(fā)明提供一種用于快速鑒定獨(dú)根草屬和槭葉草屬植物種類和產(chǎn)地的引物組合和鑒定方法，鑒別、篩選相應(yīng)的植物作為藥用的原材料。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明技術(shù)方案之一，一種用于對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定的引物組合，包括引物組1和引物組2；

4、所述引物組1由如seq?id?no.1所示的正向引物和如seq?id?no.2所示的反向引物組成；

5、所述引物組2由如seq?id?no.3所示的正向引物和如seq?id?no.4所示的反向引物組成。

6、本發(fā)明技術(shù)方案之二，一種用于對(duì)藥用植物獨(dú)根草屬、槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的產(chǎn)品，包括所述引物組合。

7、本發(fā)明技術(shù)方案之三，所述引物組合或所述產(chǎn)品在對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明技術(shù)方案之四，一種對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定的方法，包括以下步驟：

9、(1)提取待測(cè)樣本dna，以待測(cè)樣本dna為模板，利用1所述引物組合或所述產(chǎn)品進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測(cè)序；

10、(2)測(cè)序獲得的.ab1文件在geneious軟件中進(jìn)行從頭組裝，然后用geneious?r9軟件中的mafft程序進(jìn)行序列比對(duì)；比對(duì)好的矩陣導(dǎo)入dnasp?5計(jì)算不同物種、不同遺傳譜系、不同群體的單倍型數(shù)量、核苷酸多樣性和單倍型多樣性；然后利用tcs軟件構(gòu)建簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖譜，以闡明單倍型的遺傳結(jié)構(gòu)；

11、(3)根據(jù)所述單倍型的遺傳結(jié)構(gòu)，判定待測(cè)樣本的種屬及產(chǎn)地。

12、基于上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

13、(1)本發(fā)明收集了222份獨(dú)根草，139份槭葉草，50份巖槭葉草樣品(表1)，試驗(yàn)材料基本覆蓋了其自然分布范圍(圖1)。

14、(2)在獨(dú)根草、槭葉草、巖槭葉草中各挑選一個(gè)樣品進(jìn)行淺層次基因組重測(cè)序。

15、(3)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)展葉綠體基因組組裝、注釋、遺傳多樣性分析，以篩選出高變異區(qū)域。

16、(4)針對(duì)高變異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并對(duì)所有樣品進(jìn)行dna提取，pcr擴(kuò)增。

17、(5)擴(kuò)增的序列比對(duì)后，統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)量、類型、多樣性，構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖、鄰接樹(shù)，根據(jù)結(jié)果綜合判斷引物組合能可靠、準(zhǔn)確、有效地鑒定物種和產(chǎn)地。本發(fā)明的2對(duì)dna引物組合在鑒定獨(dú)根草屬和槭葉草屬植物種類和產(chǎn)地的過(guò)程中，不用考慮植株的生長(zhǎng)發(fā)育階段、植物形態(tài)，鑒定成功率比表型鑒定技術(shù)高，且成本更加低廉。

技術(shù)特征：

1.一種用于對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定的引物組合，其特征在于，包括引物組1和引物組2；

2.一種用于對(duì)藥用植物獨(dú)根草屬、槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的產(chǎn)品，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述引物組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，包括試劑、試劑盒和芯片。

4.如權(quán)利要求1所述引物組合或權(quán)利要求2所述產(chǎn)品在對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定中的應(yīng)用。

5.一種對(duì)獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類進(jìn)行分類地位和產(chǎn)地鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為35μl：1μl濃度為50ng/μl的模板dna、13.7μl?ddh2o、1.4μl正向引物、1.4μl反向引物和17.5μl?pcrmix；

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，判定待測(cè)樣本的種屬及產(chǎn)地的方法為：如果所述單倍型的遺傳結(jié)構(gòu)是or1-or13，則所述待測(cè)樣本是獨(dú)根草屬；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，判定待測(cè)樣本的種屬及產(chǎn)地的方法為：如果所述單倍型的遺傳結(jié)構(gòu)是or1-or4，則所述待測(cè)樣本產(chǎn)地是武陵山地區(qū)；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于藥用植物獨(dú)根草屬、槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的引物組合及鑒定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括引物組1和引物組2；所述引物組1由如SEQ?ID?NO.1所示的正向引物和如SEQ?ID?NO.2所示的反向引物組成；所述引物組2由如SEQ?ID?NO.3所示的正向引物和如SEQ?ID?NO.4所示的反向引物組成。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了用于獨(dú)根草屬和槭葉草屬種類及產(chǎn)地鑒定的引物組合及鑒定方法。本發(fā)明應(yīng)用葉綠體分子標(biāo)記技術(shù)以更靈敏和高效的鑒定手段對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，與傳統(tǒng)的表型鑒定相比，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠、快速簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于獨(dú)根草屬和槭葉草屬物種的快速鑒定、譜系地理學(xué)研究、品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和分子標(biāo)記輔助育種等方面。

技術(shù)研發(fā)人員：夏茂芹,劉路賢,李攀,李洪雷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶文理學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6