本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、dc-cik細(xì)胞，即樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞，是一種結(jié)合了樹突狀細(xì)胞(dc)的抗原呈遞功能和cik細(xì)胞的殺傷功能的免疫細(xì)胞。dc細(xì)胞能夠有效地將腫瘤抗原提呈給t細(xì)胞，而cik細(xì)胞則具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。

2、dc-cik細(xì)胞在腫瘤免疫治療中顯示出巨大的潛力，它們能夠有效地識別并攻擊腫瘤細(xì)胞，同時(shí)通過分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)免疫反應(yīng)。這種細(xì)胞療法被認(rèn)為是腫瘤過繼免疫治療的首選方案之一。然而，盡管dc-cik細(xì)胞在腫瘤治療中顯示出潛力，但現(xiàn)有的制備方法存在一些局限性，如cik細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境不利于dc細(xì)胞生長、dc細(xì)胞成熟慢、生存期短等問題，這些問題限制了dc-cik細(xì)胞的擴(kuò)增和殺傷功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法，增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力，可以顯著提高其對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，并增強(qiáng)免疫記憶效應(yīng)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

4、(1)將結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞；

5、(2)將培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞和dc-cik細(xì)胞混合后共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)產(chǎn)物；

6、(3)在共培養(yǎng)產(chǎn)物中加入brefeldina溶液和莫能菌素溶液進(jìn)行阻斷，得到阻斷產(chǎn)物；

7、(4)將阻斷產(chǎn)物離心，將沉淀重懸后封閉，得到細(xì)胞因子分泌能力增強(qiáng)的dc-cik。

8、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述的結(jié)腸癌細(xì)胞為sw480結(jié)腸癌細(xì)胞。

9、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述結(jié)腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)前需要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；

10、所述預(yù)培養(yǎng)的方法包括如下步驟：

11、a、將結(jié)腸癌細(xì)胞在35～39℃、4～6％co2條件下靜置44～52h，將培養(yǎng)基更換為含有8～12％fbs的1640培養(yǎng)基；

12、b、等到細(xì)胞融合度達(dá)到75～85％時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代；

13、c、去掉培養(yǎng)液上清，用pbs清洗細(xì)胞后用胰酶消化；

14、d、加入含有8～12％fbs的1640培養(yǎng)基，離心后重懸，得到預(yù)培養(yǎng)后的sw480結(jié)腸癌細(xì)胞；

15、所述離心的條件為：300～500g離心5～10min。

16、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述培養(yǎng)的條件為35～39℃、4～6％co2，所述培養(yǎng)的時(shí)間為22～26h。

17、作為優(yōu)選，步驟(2)中所述培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞和dc-cik細(xì)胞的數(shù)量比為1：0.8～1.2。

18、作為優(yōu)選，步驟(2)中所述共培養(yǎng)的條件為35～39℃、4～6％co2，所述培養(yǎng)的時(shí)間為18～22h。

19、作為優(yōu)選，步驟(3)中所述brefeldina溶液的終濃度為3～5mg/ml，所述莫能菌素溶液的終濃度為3～5mg/ml，所述阻斷的時(shí)間為4～5h。

20、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述離心的條件為：280～320g、4～6min，所述重懸時(shí)采用fbs進(jìn)行重懸。

21、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述封閉時(shí)采用humanbd?fc?block，所述封閉的時(shí)間為8～12min。

22、本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)將結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞；(2)將培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞和dc-cik細(xì)胞混合后共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)產(chǎn)物；(3)在共培養(yǎng)產(chǎn)物中加入brefeldina溶液和莫能菌素溶液進(jìn)行阻斷，得到阻斷產(chǎn)物；(4)將阻斷產(chǎn)物離心，將沉淀重懸后封閉，得到細(xì)胞因子分泌能力增強(qiáng)的dc-cik。本發(fā)明利用結(jié)腸癌細(xì)胞對dc-cik細(xì)胞的刺激作用，通過特定的培養(yǎng)條件共刺激，從而得到增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌能力的dc-cik細(xì)胞。增強(qiáng)了細(xì)胞因子分泌能力，顯著提高其對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，并增強(qiáng)免疫記憶效應(yīng)。

技術(shù)特征：

1.一種增強(qiáng)dc-cik細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的結(jié)腸癌細(xì)胞為sw480結(jié)腸癌細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述結(jié)腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)前需要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述培養(yǎng)的條件為35～39℃、4～6％co2，所述培養(yǎng)的時(shí)間為22～26h。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中所述培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞和dc-cik細(xì)胞的數(shù)量比為1：0.8～1.2。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中所述共培養(yǎng)的條件為35～39℃、4～6％co2，所述培養(yǎng)的時(shí)間為18～22h。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中所述brefeldin?a溶液的終濃度為3～5mg/ml，所述莫能菌素溶液的終濃度為3～5mg/ml，所述阻斷的時(shí)間為4～5h。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中所述離心的條件為：280～320g、4～6min，所述重懸時(shí)采用fbs進(jìn)行重懸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～8任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中所述封閉時(shí)采用human?bd?fc?block，所述封閉的時(shí)間為8～12min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)DC?CIK細(xì)胞因子分泌能力的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)將結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞；(2)將培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細(xì)胞和DC?CIK細(xì)胞混合后共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)產(chǎn)物；(3)在共培養(yǎng)產(chǎn)物中加入BrefeldinA溶液和莫能菌素溶液進(jìn)行阻斷，得到阻斷產(chǎn)物；(4)將阻斷產(chǎn)物離心，將沉淀重懸后封閉，得到細(xì)胞因子分泌能力增強(qiáng)的DC?CIK。本發(fā)明利用結(jié)腸癌細(xì)胞對DC?CIK細(xì)胞的刺激作用，通過特定的培養(yǎng)條件共刺激，從而得到增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌能力的DC?CIK細(xì)胞。增強(qiáng)了細(xì)胞因子分泌能力，顯著提高其對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，并增強(qiáng)免疫記憶效應(yīng)。

技術(shù)研發(fā)人員：謝院榮,張軍,葉茂,王仕米,余泳瑜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東壹加再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2