本發(fā)明屬于小麥抗病育種，涉及用于檢測抗赤霉病qtl?qfhb-yaas-4al的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥赤霉病(fusarium?head?blight，fhb)是由禾谷鐮刀菌等鐮刀菌引起的真菌性病害。因麥穗發(fā)病后，會導(dǎo)致失水枯干，民間俗稱爛麥頭等，主要在長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)等溫暖潮濕的地區(qū)發(fā)生較重。小麥感染赤霉病會影響灌漿降低粒重，直接影響產(chǎn)量，一般發(fā)生年份平均減產(chǎn)5％-15％，大流行年份可減產(chǎn)高達20％-50％。而籽粒干癟和不完善粒的增多，也會降低小麥籽粒蛋白質(zhì)、面筋含量和出粉率，進一步影響加工品質(zhì)。此外，感病麥粒含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)等有毒物質(zhì)，嚴重危害人畜健康。2015年、2016年、2018年黃淮麥區(qū)相繼偏重以上流行發(fā)生，嚴重影響小麥生產(chǎn)，危害糧食安全。

2、小麥對赤霉病的抗性主要包括抗侵染類型(type?i)、抗擴展類型(type?ii)、籽?？剐灶愋?type?iii)、耐病型(type?iv)和抗毒素積累型(type?v)五種類型。目前針對抗擴展(type?ii)類型的研究較多，常用鑒定方法為單花滴注法，即通過人工將赤霉病病原菌接種到麥穗中間小花，在保濕情況下，一定時間后調(diào)查病小穗率(感病小穗數(shù)/總小穗數(shù)*100％)，通過病小穗率的高低評價抗性水平。小麥赤霉病是多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，多年來，國內(nèi)外研究人員在小麥21條染色體上，通過關(guān)聯(lián)分析等方法鑒定了近250個抗赤霉病基因/qtl，經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)7個抗赤霉病基因(qtl)的抗性較為穩(wěn)定、且效應(yīng)值較大，即fhb1～fhb7。其中fhb1、fhb2分別來源于普通小麥蘇麥3號的3b和6b染色體。fhb3來源于近緣物種大賴草7lr#1s染色體。fhb4、fhb5來源于普通小麥望水白4b和5a染色。fhb6來源于近緣物種披堿草屬1e(ts)#1s。fhb7來源于近緣物種長穗偃麥草7e染色體。fhb1、fhb2和fhb4、fhb5、fhb8、fhb9均來源于普通小麥。前者與小麥抗擴展性(type?ii)相關(guān)，后者與抗侵入(type?i)相關(guān)，其中fhb1是目前國內(nèi)外公認的效應(yīng)最大的抗赤霉病qtl，抗性表現(xiàn)穩(wěn)定。fhb3、fhb6和fhb7來源小麥近緣物種，在研究和利用上均相對較少。

3、目前生產(chǎn)上，小麥赤霉病的防治主要采用化學(xué)藥劑，能在一定程度上減輕發(fā)病程度。但赤霉病重發(fā)年份，此類手段效果一般。同時化學(xué)防治還會增加小麥生產(chǎn)成本以及對環(huán)境的產(chǎn)生極為不良的影響，因此，化學(xué)防治等手段并不能很好地解決赤霉病危害，長期的實踐證明，培育和推廣抗病品種，是解決赤霉病危害的最有效的途徑。上世紀40年代我國科學(xué)家就開始對地方抗病品種進行改良，已經(jīng)取得顯著進展，選育出一批抗性好的品種。例如病害較重的南大2419中選育出中抗赤霉病品種萬年2號。江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所從阿夫(funo)中選育的揚麥1號以及揚麥3號。之后，蘇州農(nóng)科所以阿夫和中國臺灣小麥為親本，采用雜交育種方法育成抗病小麥品種蘇麥3號，在多年多點赤霉病抗性鑒定中均表現(xiàn)為高抗，是目前世界公認的赤霉病抗性最好的抗源之一。江蘇省農(nóng)科院以阿夫、安徽11和蘇麥3號為親本雜交選育的小麥品系寧7840，在多年多點赤霉病抗性鑒定均有較好的抗性，相較于蘇麥3號，寧7840農(nóng)藝性狀上得到明顯改善，但仍然因植株高，產(chǎn)量潛力一般，未能在生產(chǎn)上廣泛推廣。程順和等提出，用常規(guī)方法改良品種赤霉病抗性的工作中，在抗源未能突破的情況下，可以優(yōu)先選用一批具有一定抗性的品種作為親本，后代選擇過程中，注重豐產(chǎn)性同時兼顧抗赤霉病等綜合抗性的篩選?；诖朔N育種路線育成了中抗品種揚麥158，并得到大面積推廣應(yīng)用，初步解決了大面積豐產(chǎn)與赤霉病抗性相結(jié)合的難題。此后在長江中下游麥區(qū)一批類似品種相繼育成，例如寧麥9號、揚麥14和揚麥17等。隨后以揚麥158與寧麥9號作為骨干親本又育成了多個抗性好的小麥品種，例如華麥5號(揚麥158/ph82-2-2)，寧麥資119(意大利軟質(zhì)小麥/寧麥132)和生選6號(寧麥8號/寧麥9號)等。這些工作雖然沒有培育出免疫赤霉病的品種，但大大提升了長江中下游小麥品種的赤霉病抗性能力。

4、全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)是通過對目標(biāo)性狀的鑒定和基因分型，使用統(tǒng)計學(xué)的方法檢測兩者的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從而達到鑒定基因和定位基因的目的。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥、水稻和玉米等多種農(nóng)作物的數(shù)量性狀遺傳研究中。常用的關(guān)聯(lián)分析模型有混合線性模型(mixed?linear?model，mlm)和一般線性模型(general?linear?model，glm)?；旌暇€性模型(mlm模型)，是利用主成分分析(pca)和親緣關(guān)系矩陣(k)作為協(xié)變量，計算基因型和表型之間的線性回歸關(guān)系；一般線性模型(glm模型)是采用群體結(jié)構(gòu)(q)或主成分(pca)作為協(xié)變量。隨著高通量snp標(biāo)記分型技術(shù)和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，小麥基因分型的成本逐漸降低。同時表型鑒定體系的逐步完善，促進表型數(shù)據(jù)也越來越準(zhǔn)確。兩者結(jié)合使全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)在小麥各種復(fù)雜性狀例如赤霉病、穗發(fā)芽、條銹病產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳研究中應(yīng)用越來越廣泛?？赏ㄟ^獲取個體的基因型數(shù)據(jù)和多年的表型數(shù)據(jù)，利用此分析方法鑒定出大量控制復(fù)雜性狀的相關(guān)基因/qtl，已經(jīng)成為農(nóng)作物遺傳改良研究中的重要工具。

5、小麥赤霉病遺傳機制較為復(fù)雜，表型鑒定繁瑣且易受環(huán)境的影響，極大的限制了小麥赤霉病抗性遺傳改良。隨著抗赤霉病基因(qtl)的定位與克隆和分子標(biāo)記的研究不斷深入，培育抗病品種過程中，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。與常規(guī)育種相比，分子育種在低世代既可進行快速和準(zhǔn)確的篩選，顯著提高了抗赤霉病品種的選擇效率并縮短育種周期。因此收集長江中下游小麥品種資源，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，挖掘新的抗赤霉病基因/qtl，并轉(zhuǎn)化為可供選擇的分子標(biāo)記，創(chuàng)制優(yōu)良的抗赤霉病種質(zhì)資源，對小麥抗赤霉病育種具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種用于檢測抗赤霉病qtlqfhb-yaas-4al的分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明利用wheat16k小麥高通量基因芯片獲取基因型數(shù)據(jù)，檢測到來源于抗病品種的1個與赤霉病抗性相關(guān)的主效qtl位點qfhb-yaas-4al，并據(jù)此開發(fā)了1個kasp標(biāo)記及引物組，用以對赤霉病抗性高低進行高效篩選。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種與小麥赤霉病抗性主效qtl?qfhb-yaas-4a?l連鎖的kasp分子標(biāo)記，所述kasp分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

3、另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位等位變異是cc、還是tt、還是c和t的引物組，

4、所述引物組含有兩條上游引物和一條下游引物；

5、所述上游引物根據(jù)所述小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸及其上游序列進行設(shè)計，且一條所述上游引物的3’末端脫氧核糖核苷酸為c，另一條所述上游引物的3’末端脫氧核糖核苷酸為t；

6、所述下游引物根據(jù)所述小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸的下游序列進行設(shè)計。

7、進一步地，一條所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，另一條所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

8、進一步地，一條所述上游引物的5’末端連接熒光標(biāo)簽序列fam，另一條所述上游引物的5’末端連接熒光標(biāo)簽序列hex。

9、另一方面，本發(fā)明還提供了含有所述的引物組的檢測試劑盒。

10、另一方面，本發(fā)明還提供了所述的引物組或所述的試劑盒在如下任一中的應(yīng)用：

11、(a)鑒定或輔助鑒定小麥抗赤霉病性狀；

12、(b)比較待測小麥籽粒的赤霉病抗性強弱；

13、(c)選育或篩選赤霉病抗性相對較強的小麥單株或株系或品系或品種；

14、(d)選育或篩選赤霉病抗性相對較弱小麥單株或株系或品系或品種；

15、(e)制備用于比較待測小麥赤霉病抗性強弱的產(chǎn)品；

16、(f)制備用于選育或篩選赤霉病抗性相對較強的小麥單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品；

17、(g)制備用于選育或篩選赤霉病抗性相對較弱的小麥單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品。

18、另一方面，本發(fā)明還提供了如下任一方法：

19、方法a：一種檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位等位變異是cc、還是tt、還是c和t的方法，包括如下步驟(a1)或(a2)：

20、(a1)直接測序；

21、(a2)用所述的引物組或所述的試劑盒對待測小麥基因組dna進行pcr擴增，將所擴增的產(chǎn)物進行熒光信號掃描，對掃描數(shù)據(jù)進行分析，然后按照如下確定所述待測小麥基因中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是cc、還是tt、還是c和t：

22、若所述待測小麥的擴增產(chǎn)物的熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)kluster?caller軟件分析顯示為紅色，則所述待測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是c的純合體；

23、若所述待測小麥的擴增產(chǎn)物的熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)kluster?caller軟件分析顯示為藍色，則所述待測小麥基因組中染色體4aseq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是t的純合體；

24、若所述待測小麥的擴增產(chǎn)物的熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)kluster?caller軟件分析顯示為綠色，則所述待測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是c和t的雜合體；

25、方法b：一種比較待測小麥赤霉病抗性的方法，包括如下步驟：

26、(b1)檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是cc還是tt還是c和t；

27、(b2)按照如下確定所述待測小麥赤霉病抗性：基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是t的純合體的所述待測小麥赤霉病抗性強于基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是c的純合體或者是c和t的雜合體的所述待測小麥的赤霉病抗性；

28、方法c：一種選育或篩選赤霉病抗性相對較強的小麥單株或株系或品系或品種的方法，包括如下步驟：

29、(c1)檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是cc還是tt還是c和t；

30、(c2)選擇基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是t的純合體的待測小麥作為親本進行選育，并在育種各世代選擇基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是t的純合體的小麥，最終獲得赤霉病相對較強的小麥單株或株系或品系或品種；

31、方法d：一種選育或篩選赤霉病抗性相對較弱的小麥單株或株系或品系或品種的方法，包括如下步驟：

32、(d1)檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是cc還是tt還是c和t；

33、(d2)選擇基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是c的純合體的待測小麥作為親本進行選育，并在育種各世代選擇基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是c的純合體的小麥，最終獲得赤霉病抗性相對較弱的小麥單株或株系或品系或品種。

34、進一步地，在所述方法b、所述方法c和所述方法d中，所述檢測小麥基因組中染色體4a上seq?id?no.4所示核苷酸序列中第23位脫氧核糖核苷酸是cc還是tt還是c和t的方法為所述方法a。

35、另一方面，本發(fā)明還提供了所述的引物組或所述的方法在小麥分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明利用wheat16k小麥高通量基因芯片獲取基因型數(shù)據(jù)，在4a染色體上檢測到來源于抗病品種的1個與赤霉病抗性相關(guān)的主效qtl位點qfhb-yaas-4al，并進一步開發(fā)了kasp標(biāo)記以及專用引物組kasp-4al-fhb。通過實驗證明，本發(fā)明所述kasp分子標(biāo)記可用于小麥赤霉病抗性的主效qtl?qfhb-yaas-4al的分子標(biāo)記輔助選擇育種。本發(fā)明為抗赤霉病的qtl位點qfhb-yaas-4al在育種中有效利用提供了良好工具，這個標(biāo)記可快速對小麥赤霉病抗性進行篩選，為篩選攜帶優(yōu)異等位變異的小麥材料提供便捷，提高育種效率。