本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法及slwrky5過表達(dá)載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、番茄(solanum?lycopersicum?l.)是我國重要的蔬菜作物之一，常年栽培面積超過100萬hm2，鮮食番茄產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一。然而，番茄是一種對溫度和病害敏感的作物，在我國番茄設(shè)施生產(chǎn)中，會經(jīng)常遭遇高溫危害，同時(shí)病害加劇，給番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2、番茄幼苗在生長期間適宜的生長溫度約為晝溫24～26℃，夜溫18℃左右。一般品種在晝溫34℃，夜溫20℃以上即受到損害，當(dāng)溫度上升到晝溫38℃或夜溫26℃以上，番茄就會受到嚴(yán)重?fù)p傷。開花坐果期高溫則導(dǎo)致番茄花粉活力下降，柱頭外露，坐果率降低，致使產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。在溫度升高時(shí)，首先植物蒸騰作用加劇，大量失水，植物體內(nèi)水分生理失衡，造成葉片萎蔫，光合受阻，生長減緩。高溫脅迫下，細(xì)胞會產(chǎn)生大量的活性氧(ros)，造成膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化，產(chǎn)生的丙二醛還會進(jìn)一步加劇細(xì)胞膜的損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3、在高溫高濕環(huán)境下番茄還極易發(fā)生灰霉病，這是一種以灰葡萄孢(botrytiscinereal)為病原菌的壞死性真菌，主要靠其分生孢子進(jìn)行傳播，是設(shè)施栽培中的常見病害，并且生產(chǎn)中難以防治。在環(huán)境適宜時(shí)，灰霉菌通過幼嫩、衰弱的組織或傷口侵入到寄主內(nèi)，實(shí)現(xiàn)初步侵染，發(fā)病后可形成灰色霉層。隨著病菌發(fā)展，葉片出現(xiàn)水漬狀，邊緣不規(guī)則，淺褐或黃褐色病斑；果實(shí)發(fā)病果皮變成灰白色，果肉呈水漬狀、軟腐，在病斑處長出帶有絨毛的灰霉層。番茄因受灰霉菌的侵染而導(dǎo)致的損失非常嚴(yán)重，從最初的苗期生長到最后的果實(shí)運(yùn)輸銷售過程都具有嚴(yán)重破壞。

4、利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)掘番茄耐熱及抗病基因資源，并在番茄中調(diào)控其表達(dá)，是培育抗逆抗病番茄新品種的重要手段。wrky轉(zhuǎn)錄因子參與植物多種生物過程，特別是在調(diào)節(jié)生物和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用。slwrky5轉(zhuǎn)錄因子是wrky轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員，需要開發(fā)slwrky5轉(zhuǎn)錄因子在番茄栽培中提高高溫耐性并提高灰霉病抗性的相關(guān)功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為開發(fā)slwrky5轉(zhuǎn)錄因子在在番茄栽培中提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法及slwrky5過表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明通過過表達(dá)slwrky5基因顯著提高了番茄的耐熱能力并增強(qiáng)了番茄對灰霉菌的抗性。

2、本發(fā)明提供了過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，過表達(dá)slwrky5基因的制劑通過slwrky5基因的過表達(dá)提高番茄的耐熱能力并增強(qiáng)番茄對灰霉菌的抗性。

3、本發(fā)明通過調(diào)控slwrky5基因在番茄中過表達(dá)，使番茄的耐熱能力增強(qiáng)并對灰霉菌的抗性提高。

4、進(jìn)一步地，過表達(dá)slwrky5基因的制劑為slwrky5過表達(dá)載體，通過構(gòu)建slwrky5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后侵染番茄植株從而提高番茄的耐熱能力并增強(qiáng)番茄對灰霉菌的抗性。

5、進(jìn)一步地，所述侵染番茄植株過程為：將含有slwrky5過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株浸染番茄子葉。

6、進(jìn)一步地，所述過表達(dá)slwrky5基因的制劑以所述slwrky5過表達(dá)載體為唯一有效成份。

7、進(jìn)一步地，slwrky5過表達(dá)載體構(gòu)建過程為：將seq?id?no.1所示的slwrky5基因片段和線性化phellsgate8載體進(jìn)行重組獲得。

8、進(jìn)一步地，擴(kuò)增所述slwrky5基因片段的引物為seq?id?no.2所示的slwrky5-oe-fw引物和seq?id?no.3所示的slwrky5-oe-rv引物。

9、本發(fā)明還提供了一種slwrky5過表達(dá)載體的構(gòu)建方法，步驟如下：

10、slwrky5基因片段的擴(kuò)增：以番茄cdna為模板，以seq?id?no.2和seq?id?no.3所示基因片段為引物對，使用phanta酶，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得長度為1461bp的基因片段，即slwrky5基因片段；

11、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：1u/μl的phanta?max?super-fidelity?dna?polymerase1μl；2×phanta?max?buffer?25μl；10μm的上游引物2μl；10μm的下游引物2μl；dna?模板1μl；dntp?mix?1μl；ddh2o?up?to?50μl；

12、將slwrky5基因片段和線性化phellsgate8載體進(jìn)行重組獲得slwrky5過表達(dá)載體；

13、slwrky5基因片段和線性化phellsgate8載體的重組體系為：線性化載體40ng，slwrky5基因片段回收產(chǎn)物6ng，exnaseii?1ul，2×ce?ii?buffer?2ul，ddh2o補(bǔ)充到10ul。

14、本發(fā)明還提供了所述構(gòu)建方法得到的slwrky5過表達(dá)載體。

15、本發(fā)明還提供了一種提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法，包括如下步驟：

16、slwrky5基因片段的擴(kuò)增：以番茄cdna為模板，以seq?id?no.2和seq?id?no.3所示基因片段為引物對，使用phanta酶，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得長度為1461bp的基因片段，即slwrky5基因片段；

17、將slwrky5基因片段和線性化phellsgate8載體進(jìn)行重組獲得的slwrky5過表達(dá)載體；

18、slwrky5過表達(dá)載體熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并抽提重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌c58，獲得含有slwrky5過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株；

19、用含有slwrky5過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株浸染番茄子葉，構(gòu)建獲得耐高溫和抗灰霉病的番茄轉(zhuǎn)基因植株。

20、進(jìn)一步地，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃3min；變性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循環(huán)35次；終延伸72℃10min。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

22、本發(fā)明通過調(diào)控slwrky5基因在番茄中過表達(dá)，使番茄的耐熱能力和對灰霉菌的抗性提高?？寺》阎械膕lwrky5轉(zhuǎn)錄因子，并在番茄中過表達(dá)，在高溫脅迫下，slwrky5過表達(dá)植株與野生型番茄a(bǔ)ilsa?craig(ac)相比表現(xiàn)出明顯的耐熱性，相對電導(dǎo)率、丙二醛含量以及活性氧等脅迫相關(guān)指標(biāo)均顯著低于ac。用灰霉菌侵染slwrky5轉(zhuǎn)基因植株，其slwrky5過表達(dá)植株表現(xiàn)出對灰霉菌更強(qiáng)的抗性。

23、本發(fā)明開發(fā)了slwrky5基因在番茄中的新用途，過表達(dá)slwrky5基因顯著提高了番茄的耐熱能力并增強(qiáng)了番茄對灰霉菌的抗性。

技術(shù)特征：

1.過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，其特征在于，過表達(dá)slwrky5基因的制劑通過slwrky5基因的過表達(dá)提高番茄的耐熱能力并增強(qiáng)番茄對灰霉菌的抗性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，其特征在于，過表達(dá)slwrky5基因的制劑為slwrky5過表達(dá)載體，通過構(gòu)建slwrky5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后侵染番茄植株從而提高番茄的耐熱能力并增強(qiáng)番茄對灰霉菌的抗性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，其特征在于，所述侵染番茄植株過程為：將含有slwrky5過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株浸染番茄子葉。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，其特征在于，所述slwrky5過表達(dá)載體通過將seq?id?no.1所示的slwrky5基因片段和線性化phellsgate8載體進(jìn)行重組獲得。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的過表達(dá)slwrky5基因的制劑在番茄栽培中的應(yīng)用，其特征在于，擴(kuò)增所述slwrky5基因片段的引物為seq?id?no.2所示的slwrky5-oe-fw引物和seq?idno.3所示的slwrky5-oe-rv引物。

6.一種slwrky5過表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

7.一種權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法得到的slwrky5過表達(dá)載體。

8.一種提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法，其特征在于，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃3min；變性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循環(huán)35次；終延伸72℃10min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了提高番茄耐高溫能力和灰霉病抗性的方法及SlWRKY5過表達(dá)載體和應(yīng)用。過表達(dá)SlWRKY5基因用于提高番茄的耐熱能力并增強(qiáng)番茄對灰霉菌的抗性。本發(fā)明通過過表達(dá)SlWRKY5基因顯著提高了番茄的耐熱能力并增強(qiáng)了番茄對灰霉菌的抗性。

技術(shù)研發(fā)人員：李國斌,陳果,胡曉輝,李建明,賈敏,孫玚,王子怡,司倩琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北農(nóng)林科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6