本發(fā)明屬于合成生物學(xué)，具體涉及一種高產(chǎn)的基因工程重組人iv型膠原蛋白、其生產(chǎn)方法和用途。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是一種生物高分子蛋白，是動物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25％～30％。膠原蛋白種類較多，常見類型為ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和?型。膠原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

2、當(dāng)前，基因工程重組表達(dá)是生產(chǎn)膠原蛋白的重要方法之一。特別是重組人膠原，其氨基酸組成與人體的氨基酸組成一致，被認(rèn)為最接近人體天然合成的膠原蛋白，具有生物相容性好、安全性高。開發(fā)出的商業(yè)化重組人膠原蛋白產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)美容、化妝品、醫(yī)療器械、保健品等領(lǐng)域。

3、目前重組膠原的生產(chǎn)中主要存在以下問題：1)易降解，由于現(xiàn)有的表達(dá)體系下重組膠原不能像天然膠原那樣形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，易被生產(chǎn)體系中的蛋白酶降解；2)難純化，膠原易降解導(dǎo)致制備的重組膠原純化過程中除了宿主蛋白干擾之外還需要去除大量的降解蛋白，增加了純化的難度，使得高純度的目的蛋白制備變得困難；3)產(chǎn)量低，因為降解問題的存在，使得重組膠原蛋白的產(chǎn)量偏低，遠(yuǎn)未達(dá)到人們的預(yù)期。一般認(rèn)為，在使用商業(yè)化的表達(dá)宿主和表達(dá)載體的情況下，分子量7萬以上的重組膠原蛋白的產(chǎn)量達(dá)到10g/l已經(jīng)是相當(dāng)高產(chǎn)。因此，量產(chǎn)的重組膠原種類偏少，嚴(yán)重制約了重組膠原的進(jìn)一步應(yīng)用。

4、隨著重組膠原的市場接受度的逐漸提高，重組膠原的市場需求逐漸的增大，因此能夠量產(chǎn)的重組膠原蛋白是目前急需的，而能夠量產(chǎn)的重組膠原蛋白必須具備單批次產(chǎn)量高、表達(dá)的蛋白穩(wěn)定性好、易純化等特性。因此高產(chǎn)、穩(wěn)定性好、易純化的重組膠原蛋白為目前市場所急需的。

5、可以通過構(gòu)建天然膠原蛋白的截短蛋白或截短肽來獲得重組膠原蛋白。截短蛋白在天然膠原蛋白中的位置的不確定性以及長度的不確定性，使得理論上重組膠原蛋白的種類有幾千萬種。然而，關(guān)于這些重組膠原蛋白中的哪些能夠具有更高的分泌產(chǎn)量，一直缺少有效的理論指導(dǎo)，必須通過大量的實驗驗證篩選出最好的結(jié)果，這就是目前重組膠原蛋白量產(chǎn)種類少的最主要的原因。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種分泌產(chǎn)量高、安全性好且生物活性強(qiáng)的重組人iv型膠原蛋白。

2、本發(fā)明包括：

3、1.一種重組人iv型膠原蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

4、seq?id?no:1

5、

6、

7、2.編碼項1所述的重組人iv型膠原蛋白的核酸。所述核酸的核苷酸序列例如可以如seq?id?no:2所示。

8、3.包含項2所述的核酸的表達(dá)載體。

9、4.導(dǎo)入了項3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，例如可以為畢赤酵母。

10、5.一種生產(chǎn)項1所述的重組人iv型膠原蛋白的方法，其包括培養(yǎng)項4所述的宿主細(xì)胞使其分泌表達(dá)所述重組人iv型膠原蛋白，然后進(jìn)行分離純化。

11、6.根據(jù)項5所述的方法，其中，所述分離純化采用選自鹽析、色譜層析、親和層析、酸堿沉淀、膜分離中的一種或幾種的組合。優(yōu)選色譜層析與膜分離的組合，或離子交換層析與膜分離的組合。

12、7.根據(jù)項1所述的重組人iv型膠原蛋白在制備化妝品或醫(yī)療器械中的用途。

13、8.根據(jù)項8所述的用途，其中，所述化妝品或醫(yī)療器械用于改善皮膚泛紅、修護(hù)敏感肌膚。

14、9.根據(jù)項8所述的用途，其中，所述化妝品或醫(yī)療器械被制成適于施用于皮膚的形式，例如面膜、面霜、噴霧、精華水等。

15、本發(fā)明的有益效果在于：

16、1.產(chǎn)量高：在本技術(shù)領(lǐng)域，一般認(rèn)為，在使用商業(yè)化的表達(dá)宿主和表達(dá)載體的情況下，分子量7萬以上的重組膠原蛋白的產(chǎn)量達(dá)到10g/l已經(jīng)是相當(dāng)高產(chǎn)。而本發(fā)明提供了一種新的氨基酸序列組成的重組人iv型膠原蛋白，該重組人iv型膠原蛋白為人iv型膠原蛋白α1鏈的截短蛋白，無需使用特殊的表達(dá)元件和手段，該重組人iv型膠原蛋白僅通過商業(yè)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)胞外分泌表達(dá)的產(chǎn)量即可高達(dá)18g/l，顯著高于本技術(shù)領(lǐng)域認(rèn)為的重組膠原蛋白的高產(chǎn)水平，也顯著高于人iv型膠原蛋白α1鏈全長或其它截短蛋白。胞外蛋白sds-page檢測結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白占比達(dá)70％以上，且通過簡單的超濾脫色后純度可達(dá)80％。

17、2.細(xì)胞毒性明顯小于人iv型膠原蛋白α1鏈全長(見實施例3)。

18、3.促細(xì)胞粘附活性及改善皮膚泛紅、修護(hù)敏感肌功效明顯優(yōu)于人iv型膠原蛋白α1鏈全長鏈(見實施例3、實施例4)。

技術(shù)特征：

1.一種重組人iv型膠原蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述的重組人iv型膠原蛋白的核酸；所述核酸的核苷酸序列例如可以如seq?id?no:2所示。

3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。

4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，例如可以為畢赤酵母。

5.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的重組人iv型膠原蛋白的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞使其分泌表達(dá)所述重組人iv型膠原蛋白，然后進(jìn)行分離純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述分離純化采用選自鹽析、色譜層析、親和層析、酸堿沉淀、膜分離中的一種或幾種的組合；優(yōu)選色譜層析與膜分離的組合，或離子交換層析與膜分離的組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人iv型膠原蛋白在制備化妝品、外用藥品或醫(yī)療器械中的用途。

8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述化妝品、外用藥品或醫(yī)療器械用于改善皮膚泛紅、修護(hù)敏感肌膚。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述化妝品、外用藥品或醫(yī)療器械被制成適于施用于皮膚的形式；例如面膜、面霜、噴霧、精華水等。

技術(shù)總結(jié)
本專利申請公開了一種重組人IV型膠原蛋白、其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明的重組人IV型膠原蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No:1所示。該重組人IV型膠原蛋白為人IV型膠原蛋白α1鏈的截短蛋白，無需使用特殊的表達(dá)元件和手段，該重組人IV型膠原蛋白僅通過商業(yè)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)胞外分泌表達(dá)的產(chǎn)量即可高達(dá)18g/L，顯著高于本技術(shù)領(lǐng)域認(rèn)為的重組膠原蛋白的高產(chǎn)水平，也顯著高于人IV型膠原蛋白α1鏈全長或其它截短蛋白。而且，該重組人IV型膠原蛋白的安全性和生物學(xué)活性也優(yōu)于人IV型膠原蛋白α1鏈全長。

技術(shù)研發(fā)人員：范代娣,賀穎,段志廣,殷詩玉,嚴(yán)鈺博
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西安巨子生物基因技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2