本技術(shù)涉及木材材種鑒定的分子生物學(xué)檢測，且特別涉及一種鑒定檀香紫檀的引物探針組、試劑盒及鑒定方法。

背景技術(shù)：

1、檀香紫檀(p.santalinusl.f.)也稱紫檀或小葉紫檀，是制作家具和工藝品的上等原料，歷來就被用作生產(chǎn)家具或工藝品的名貴材料。

2、隨著檀香紫檀制品的需求也不斷增長；但檀香紫檀樹木的生長非常緩慢，通常需要百余年才能成材，加之不斷的采伐，檀香紫檀天然林已經(jīng)非常少見。人們對檀香紫檀需求量的猛增與其木材供給矛盾，致使近年來檀香紫檀木材市場貨源稀缺，因此市場上便出現(xiàn)了從非洲進(jìn)口的價(jià)格低廉的染料紫檀(p.tinctorius)木材，市場稱之為“血檀”或“非洲小葉紫檀”，其木材宏觀特征和解剖學(xué)特征與印度產(chǎn)檀香紫檀相似度極高，且英文商品名稱redsanders、redsandalwood與檀香紫檀一致，難以分辨，有些不法商販將染料紫檀當(dāng)作檀香紫檀產(chǎn)品來售賣；有的技術(shù)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)甚至將染料紫檀錯(cuò)判成了檀香紫檀，給用戶造成了巨大經(jīng)濟(jì)的損失，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益并擾亂了正常的市場競爭秩序。從保護(hù)消費(fèi)者利益，維護(hù)正常的市場秩序角度來說，準(zhǔn)確識別出檀香紫檀和染料紫檀已成為當(dāng)務(wù)之急。

3、另外，檀香紫檀樹木生長十分緩慢，由于多年來的采伐檀香紫檀天然林的數(shù)量已經(jīng)十分稀少，為此《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(簡稱cites公約)將其列入附錄ⅱ對其國際貿(mào)易進(jìn)行管制，對檀香紫檀的國際貿(mào)易進(jìn)行嚴(yán)格的限制，而有些木材進(jìn)口商在入關(guān)時(shí)將檀香紫檀謊報(bào)為染料紫檀，從而逃避高額的關(guān)稅和cites公約的限制。因此，從維護(hù)正常的市場秩序、保護(hù)檀香紫檀野生林、打擊非法采伐與非法木材貿(mào)易等幾方面來講，正確區(qū)分檀香紫檀和染料紫檀兩個(gè)樹種具有重要的意義。

4、gb/t18107-2000中規(guī)定檀香紫檀屬于紅木，其鑒別方法是以簡便實(shí)用的宏觀特征(如密度、結(jié)構(gòu)、材色和紋理等)為依據(jù)，輔以必要的木材解剖特征來確定其屬種。其檢測過程具體如下：1)宏觀檢驗(yàn)主要對其材色、氣味、紋理、密度等指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)；2)木材解剖特征檢驗(yàn)主要將樣品鋸解成外表面為橫、徑、弦三個(gè)切面的1立方厘米的立方體，然后將紅木小木塊軟化1天到7天左右，接下來將軟化后的小木塊固定到切片機(jī)上進(jìn)行切片，然后脫水、封片，最后上光學(xué)顯微鏡觀察木材解剖特征。

5、使用傳統(tǒng)方法檢驗(yàn)上述幾種木材的主要缺點(diǎn)在于：1)檢驗(yàn)時(shí)間長，傳統(tǒng)方法檢測需宏觀檢驗(yàn)與木材解剖學(xué)特征相結(jié)合，宏觀檢驗(yàn)?zāi)静?2％的氣干密度測試需要約3-7天時(shí)間；木材解剖特征檢驗(yàn)中的軟化、切片、脫水、封片等工序需要2-7天時(shí)間。2)檢驗(yàn)為破壞性檢驗(yàn)且用材多，傳統(tǒng)方法密度測試需要至少2cm×2cm×2cm木塊3塊；木材解剖特征檢驗(yàn)需要大小為3cm×3cm×1cm的木塊1塊，對于紅木制品的破壞嚴(yán)重。3)對于宏觀和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)近似的木材，誤判率較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本技術(shù)實(shí)施例的目的包括提供一種鑒定檀香紫檀的引物探針組、試劑盒及鑒定方法。可以特異性的和高靈敏度的對檀香紫檀進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、且破壞較小的檢測鑒定。

2、第一方面，本技術(shù)實(shí)施例提供了一種鑒定檀香紫檀的引物探針組，包括txzt特異性引物對和txzt探針，txzt特異性引物對包括正向引物和反向引物；正向引物包括如seqid?no.1所示的核苷酸序列，反向引物包括如seq?id?no.2所示的核苷酸序列，txzt探針包括如seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

3、本技術(shù)提供的核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的txzt特異性引物對及核苷酸序列如seq?id?no.3所示的txzt探針，可以對檀香紫檀的dna進(jìn)行特異性的和高靈敏度的pcr擴(kuò)增與檢測，從而可以快速、準(zhǔn)確、且破壞較小的檢測鑒定待測木材是否為檀香紫檀。

4、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，txzt探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

5、本技術(shù)在txzt探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，從而使txzt探針在對檀香紫檀的dna檢測中具有高度的特異性和靈敏度。

6、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，熒光報(bào)告基團(tuán)選自fam、cy3、cy5、rox或vic。

7、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，熒光淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、bhq3或mgb。

8、本技術(shù)通過選用適宜的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)對探針進(jìn)行標(biāo)記，從而對檀香紫檀的dna進(jìn)行特異性的和高靈敏度的檢測。

9、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，txzt特異性引物對的靶基因包括如seq?id?no.4所示的核苷酸序列。

10、本技術(shù)選擇核苷酸序列如seq?id?no.4所示的靶基因，基于該靶基因設(shè)計(jì)出上述txzt特異性引物對和txzt探針，以對檀香紫檀的dna進(jìn)行特異性的和高靈敏度的pcr擴(kuò)增與檢測。

11、第二方面，本技術(shù)實(shí)施例提供了一種鑒定檀香紫檀的試劑盒，包括如第一方面提供的引物探針組。

12、本技術(shù)提供的鑒定檀香紫檀的試劑盒，包括上述的引物探針組，可以對檀香紫檀的dna進(jìn)行特異性的和高靈敏度的pcr擴(kuò)增與檢測，從而可以快速、準(zhǔn)確、且破壞較小的檢測鑒定待測木材是否為檀香紫檀。

13、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，試劑盒還包括pcr反應(yīng)液，pcr反應(yīng)液包括dntp、dna聚合酶和pcr緩沖液。

14、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，pcr反應(yīng)液包括：按反應(yīng)體系為20-30μl計(jì)，正向引物的濃度為0.1-0.7μm，反向引物的濃度為0.1-0.7μm，txzt探針的濃度為0.3-1.5μm。

15、本技術(shù)于pcr反應(yīng)液中設(shè)置適宜濃度的正向引物、反向引物和探針，可以對檀香紫檀的dna進(jìn)行特異性的和高靈敏度的pcr擴(kuò)增與檢測。

16、第三方面，本技術(shù)實(shí)施例提供了一種檀香紫檀的鑒定方法，包括：

17、(1)提取待測木材樣本中的dna；

18、(2)采用第二方面提供的試劑盒將步驟(1)中提取的待測木材樣本中的dna為模板進(jìn)行熒光pcr檢測；

19、(3)通過熒光pcr檢測結(jié)果判斷待測木材是否為檀香紫檀。

20、本技術(shù)提供的檀香紫檀的鑒定方法先提取待測木材樣本中的dna，再通過上述包括txzt特異性引物對和txzt探針的試劑盒將提取的待測木材樣本中的dna為模板進(jìn)行熒光pcr檢測，可以快速、準(zhǔn)確、且破壞較小的檢測鑒定待測木材是否為檀香紫檀。

21、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，取0.1-2g的待測木材樣本進(jìn)行檢測鑒定。

22、本技術(shù)采用適宜量的待測木材樣本進(jìn)行檢測鑒定即可快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定結(jié)果，從而對木材的破壞性較小。

23、在本技術(shù)的部分實(shí)施例中，熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：92-98℃預(yù)變性反應(yīng)2min；93-97℃變性14-16s，55℃退火25-35s，70-74℃延伸20-25s，循環(huán)40次；72℃終延伸7-8min。

24、本技術(shù)采用適宜的熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測，可以特異性的和高靈敏度的進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。