本發(fā)明涉及分子遺傳育種，具體涉及一種鑒定小麥籽粒硬度pina-d1e和pinb-d1i基因的kasp引物及其在小麥種質(zhì)鑒定和小麥育種中的應用。

背景技術(shù)：

1、小麥是第三大糧食作物，約占全球40％人口主糧，提供超過20％的能量和蛋白質(zhì)。籽粒硬度是評價小麥品質(zhì)的重要參數(shù)，也是小麥分類、分級、定價和加工的重要評價指標，并決定了小麥的最終用途。不僅影響小麥的加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，對其深加工也有重要影響。隨著人們生活水平的提高，對優(yōu)質(zhì)小麥的需求持續(xù)增長，導致供需關(guān)系出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性的不平衡。因此有必要通過遠緣雜交導入外源有利基因，加強對籽粒硬度基因優(yōu)異資源的挖掘，提高小麥品質(zhì)，滿足人們對高品質(zhì)生活的需求。

2、snp(single?nucleotide?polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)是dna序列中特定位置上的微小變異，這些變異包括核苷酸的替換、顛倒、增加或減少。通過對比已知的dna序列，可以定位這些snp位點。根據(jù)這些變異位點設(shè)計出特異性的引物，進而對dna或其互補序列進行pcr擴增，以產(chǎn)生基于snp的遺傳多態(tài)性產(chǎn)物。通過電泳分析，可以揭示這些產(chǎn)物的遺傳變異模式。snp作為一種遺傳標記，因其在基因組中的廣泛分布、數(shù)量眾多以及易于估計的等位基因頻率，對于遺傳學研究具有顯著的應用價值。

3、kasp(kompetitiveallele?specific?pcr，競爭性等位基因特異性pcr)是一種成本效益高、操作簡便、準確性高的基因分型技術(shù)，適用于高通量和自動化的基因檢測。現(xiàn)已經(jīng)在小麥、水稻、大豆等作物的種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系研究、分子標記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位和種子純度鑒定等方面中得到廣泛應用。

4、小麥籽粒硬度是數(shù)量性狀，存在多個數(shù)量性狀位點(qtl)，主效qtl位點由位于5d染色體短臂上的亞端部區(qū)域的ha(硬度)位點控制，ha位點由pina、pinb組成，當pina和pinb二者均為野生型時，籽粒表現(xiàn)為軟質(zhì)，其中一個缺失或發(fā)生突變時表現(xiàn)為硬質(zhì)，且軟質(zhì)相對于硬質(zhì)為顯性。節(jié)節(jié)麥(aegilops?tauschii,2n＝2x＝14，dd)是山羊草屬一年生植物，是普通小麥d基因組的供體，擁有很多pina、pinb等位變異類型如pina-d1c、pina-d1d、pina-d1e、pina-d1f、pina-d1g、pina-d1h、pinb-d1h、pinb-d1i、pinb-d1k、pinb-d1m、pinb-d1n、pinb-d1o，這些變異都是多點突變，表現(xiàn)出軟質(zhì)。另外，來自的節(jié)節(jié)麥等位基因型pina-d1e/pinb-d1i(編碼蛋白為pinac/pinbh)可在人工合成小麥中表達，比含pina-d1a/pinb-d1a(編碼蛋白為pinaa/pinba)的籽粒更加柔軟。研究表明，pin基因可能在影響籽粒硬度的同時，對籽粒大小存在調(diào)節(jié)作用。因此，節(jié)節(jié)麥的籽粒硬度基因pina和pinb可用于普通小麥籽粒硬度性狀的改良，利用人工合成小麥為橋梁，結(jié)合分子標記輔助育種將其轉(zhuǎn)移到普通小麥中，用于培育籽粒更軟的小麥品種。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種鑒定小麥籽粒硬度pina-d1e和pinb-d1i基因的kasp引物及應用，可在群體中快速鑒定含有pina-d1e基因和pinb-d1i基因的小麥植株。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種與小麥籽粒硬度pina-d1e基因和pinb-d1i基因連鎖的kasp引物，可實現(xiàn)小麥籽粒硬度的鑒定，輔助和加快小麥種質(zhì)鑒定和小麥育種效率。

3、本發(fā)明提供了一種鑒定小麥籽粒硬度pina-d1e和pinb-d1i基因的kasp引物，該kasp引物包含核苷酸序列如seq?id?no.1～3和seq?id?no.4～6所示的6條引物，其中，鑒定pina-d1e基因的kasp引物多態(tài)性為t/c，鑒定pinb-d1i基因的kasp引物多態(tài)性為g/a。

4、本發(fā)明還提供了一種鑒定小麥籽粒硬度基因的試劑盒，該試劑盒包含核苷酸序列如seq?id?no.1～3和seq?id?no.4～6所示的6條引物，該試劑盒可用于小麥籽粒硬度基因鑒定中，該籽粒硬度基因為pina-d1e和pinb-d1i基因。

5、本發(fā)明提供的kasp引物或試劑盒可用于小麥育種中，包含不同籽粒硬度小麥品系的創(chuàng)制。

6、本發(fā)明還提供了一種小麥籽粒硬度的鑒定方法，包含如下步驟：

7、(1)利用ctab法提取待測小麥樣品的基因組dna；

8、(2)以提取的dna為模板，利用上述的6條kasp引物進行pcr擴增；反應體系為10μl：5μlkasp?mastermix、1.4μl引物混合物、100ng基因組dna和2.6μl?ddh2o。擴增程序：94℃15min，94℃10個20s的觸底循環(huán)，65-57℃60s，94℃32個20s的循環(huán)，57℃60s；

9、(3)檢測pcr擴增產(chǎn)物的熒光，當擴增產(chǎn)物的熒光為黃色熒光時，代表該小麥的籽粒硬度基因為pina-d1e/pinb-d1i，且為純合；當擴增產(chǎn)物的熒光為綠色熒光時，代表該小麥存在pina-d1e/pinb-d1i籽粒硬度基因，且為雜合；當擴增產(chǎn)物的熒光為藍色熒光時，代表該小麥不存在pina-d1e/pinb-d1i籽粒硬度基因。

10、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

11、本發(fā)明首次公開了基于熒光定量pcr平臺精確檢測來自節(jié)節(jié)麥as60的籽粒硬度基因pina-d1e和pinb-d1i的分子標記引物，其核苷酸序列分別如seq?id?no.1～6所示。其中針對pina-d1e基因的kasp引物可以區(qū)分pina-d1a、pina-d1c、pina-d1d；針對pinb-d1i基因的kasp引物可以區(qū)分pinb-d1a、pinb-d1h。且為共顯性標記，檢測準確高效、擴增方便穩(wěn)定。

12、本發(fā)明公開的kasp分子標記引物與籽粒硬度基因pina-d1e和pinb-d1i極顯著相關(guān)，呈現(xiàn)連鎖標記特征，用于分子標記及其引物輔助選擇的準確性高，且成功率高。可用于小麥籽粒硬度的鑒定，輔助和加快小麥種質(zhì)鑒定和小麥育種效率，實用價值顯著。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定小麥籽粒硬度pina-d1e和pinb-d1i基因的kasp引物，其特征在于，該kasp引物包含核苷酸序列如seq?id?no.1～3和seq?id?no.4～6所示的6條引物，其中，鑒定pina-d1e基因的kasp引物多態(tài)性為t/c，鑒定pinb-d1i基因的kasp引物多態(tài)性為g/a。

2.一種鑒定小麥籽粒硬度基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1所述的kasp引物，其中，所述的籽粒硬度基因為pina-d1e和pinb-d1i基因。

3.如權(quán)利要求1所述的kasp引物或權(quán)利要求2所述的試劑盒在小麥籽粒硬度基因鑒定中的應用。

4.如權(quán)利要求1所述的kasp引物或權(quán)利要求2所述的試劑盒在小麥育種中的應用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述的應用包含不同籽粒硬度小麥品系的創(chuàng)制。

6.一種小麥籽粒硬度的鑒定方法，其特征在于，包含如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種鑒定小麥籽粒硬度Pina?D1e和Pinb?D1i基因的KASP引物及應用，該KASP引物包含兩組共6條引物，其核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO.1、2、3，SEQ?ID?NO.4、5、6所示。由該KASP引物擴增所得KASP分子標記為共顯性標記。本發(fā)明提供的KASP引物能準確地跟蹤小麥籽粒硬度Pina?D1e基因和Pinb?D1i基因，能夠提高軟質(zhì)小麥創(chuàng)制的準確性，可用于小麥品質(zhì)育種，大大加快優(yōu)質(zhì)小麥品種的選育進程。

技術(shù)研發(fā)人員：張連全,葉紅,苗永平,吳雷,沈茫,楊浩帆,郝明,黃林,甯順腙,姜博,袁中偉,陳雪姣,陳雪,劉登才
受保護的技術(shù)使用者：四川農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6