本發(fā)明涉及生物工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)生成式擴(kuò)散模型rfdiffusion設(shè)計(jì)的高活性果膠裂解酶（pl-ds11）及其制備方法和在工業(yè)上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、果膠裂解酶(pl)是果膠酶的一種，它催化果膠分子鏈的消除裂解，在食品加工工業(yè)中，提高果汁產(chǎn)量方面有重要意義。果膠裂解酶(反式消去酶)是通過(guò)反式消去作用裂解果膠聚合體的一種果膠酶，裂解酶在c一4位置上斷開(kāi)糖苷鍵，同時(shí)從c一5處消去一個(gè)h原子從而產(chǎn)生一個(gè)不飽和產(chǎn)物。果膠裂解酶是一類能夠催化果膠物質(zhì)降解的酶，在食品加工、飼料加工、紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。提高果膠裂解酶的活性和穩(wěn)定性對(duì)于提升工業(yè)生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

2、傳統(tǒng)的酶工程方法，如定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)，雖然在提高酶的性能方面取得了一定成果，但仍存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、探索序列空間有限等局限性。隨著深度學(xué)習(xí)和擴(kuò)散模型技術(shù)的發(fā)展，利用深度學(xué)的擴(kuò)散模型進(jìn)行蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)和優(yōu)化具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。擴(kuò)散模型rfdiffusion是一種基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)擴(kuò)散生成模型，能夠有效地根據(jù)蛋白質(zhì)序列中結(jié)構(gòu)信息，從而生成新型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種高活性果膠裂解酶pl-ds11，其酶活性相比野生型果膠裂解酶（wt）提高了約4.3倍。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、一種基于擴(kuò)散模型rfdiffusion設(shè)計(jì)的果膠裂解酶突變體pl-ds11，其氨基酸序列如seq?id?no:2所示。是利用rfdiffusion模型，以野生型果膠裂解酶的序列和結(jié)構(gòu)（uniprotkb:?d0vp31?/?pdb?id:?3vmv）為輸入，結(jié)合多序列比對(duì)(msa)分析，保持約75%的高度保守殘基不變，對(duì)其余約25%的非保守殘基進(jìn)行序列變異設(shè)計(jì)，篩選獲得了高活性果膠裂解酶突變體pl-ds11。

4、篩選過(guò)程是通過(guò)模型生成的多個(gè)變異序列中，利用alphafold2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和質(zhì)量評(píng)估，通過(guò)活性篩選獲得了活性提升顯著的突變體pl-ds11。

5、本發(fā)明制備果膠裂解酶突變體pl-ds11的方法，包括以下步驟：

6、i.合成pl-ds11基因序列并克隆至表達(dá)載體中；

7、ii.?將重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；

8、iii.?獲得高活性的pl-ds11果膠裂解酶。

9、具體技術(shù)方案如下：

10、1.?pl-ds11突變體的獲得

11、序列設(shè)計(jì)：利用rfdiffusion模型，以野生型果膠裂解酶的序列和結(jié)構(gòu)（uniprotkb:?d0vp31?/?pdb?id:?3vmv）為輸入，結(jié)合多序列比對(duì)（msa）分析，保持約75%的高度保守殘基不變，對(duì)其余約25%的非保守殘基進(jìn)行序列變異設(shè)計(jì)。通過(guò)模型生成多個(gè)變異序列，利用alphafold2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和質(zhì)量評(píng)估，篩選獲得酶活性顯著提高的突變體pl-ds11。

12、候選序列篩選：通過(guò)模型生成的多個(gè)變異序列中，利用alphafold2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，評(píng)估其穩(wěn)定性和活性潛力，最終通過(guò)酶活性篩選，確定活性提升顯著的突變體pl-ds11。

13、2.?pl-ds11與wt序列的差異氨基酸位點(diǎn)

14、wt果膠裂解酶序列（seq?id?no:1）：gpqgyasmnggttggaggrveyastgaqiqqlidnrsrsnnpdepltiyvngtitqgnspqslidvknhrgkaheiknisiigvgtngefdgigirlsnahniiiqnvsihhvregegtaievtddsknvwidhnefysefpgngdsdyydglvdmkrnaeyitvswnkfenhwktmlvghtdnaslapdkityhhnyfnnlnsrvpliryadvhmfnnyfkdindtainsrvgarvfvennyfdnvgsgqadpttgfikgpvgwfygspstgywnlrgnvfvntpnshlnsttnftppysyqvqsatqakssveqhsgvgvin

15、pl-ds11果膠裂解酶序列（seq?id?no:2）：tvtgyaslnggttggsggktvtattgkeiqqlikdrclsgktdepltiyvngtitpensdsglidvknhrtktapiknisiigvgtkgefdgigirltsahniiiqnvkihhvkeesgngievtdgsknvwidhnefysgetlpddsdyydglvdfkrnaeyitvswnkfenhwkamlvghtdnlelrsdnityhhnlfsnlnsrvpliryanvhmfnnyfkditdtainsrvgarvyvennyfdnvgskekdketgkvgtpvgnfyessengywnlsgnifnntntenlgsttnftppysydvldaetakekvlkesgvgnnl

16、差異氨基酸位點(diǎn)信息：

17、通過(guò)對(duì)比wt與pl-ds11的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)pl-ds11共有91個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了替換。以下列出主要的突變位點(diǎn)（序列位置參照wt序列）：

18、突變位點(diǎn)列表：

19、g1t,p2v,q3t,m8l,a16s,r19k,v20t,e21v,y22t,s24t,a27k,q28e,d34k,n35d,s37c,r38l,n40g,n41k,p42t,q56p,g57e,p60d,q61s,s62g,g71t,a73t,h74a,e75p,n87k,s98t,n99s,s109k,r114k,g116e,e117s,t119n,a120g,d126g,e140g,f141e,p142t,g143l,n144p,g145d,m156f,t176a,a185l,s186e,a188r,p189s,k191n,y198l,n200s,d213n,n225t,f238y,g250k,q251e,a252k,p254k,t255e,f258k,i259v,k260g,g261t,w265n,g268e,p270s,s271e,t272n,r278s,v281i,v283n,p286n,n287t,s288e,h289n,n291g,q303d,q305l,s306d,t308e,q309t,s312e,s313k,e315l,q316k,h317e,v322n,i323n,n324l。

20、3.?pl-ds11的制備方法

21、基因合成：根據(jù)pl-ds11的氨基酸序列，采用反向翻譯和密碼子優(yōu)化的方法，合成對(duì)應(yīng)的基因序列。優(yōu)化過(guò)程中考慮了宿主菌（如大腸桿菌）的密碼子使用偏好，以提高基因的表達(dá)效率。

22、載體構(gòu)建：將合成的pl-ds11基因序列克隆至原核表達(dá)載體，例如pet-28a(+)。利用特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（如ncoi和xhoi）進(jìn)行酶切和連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pet-28a(+)-pl-ds11。

23、表達(dá)與純化：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21（de3）中。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，使用iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體后，采用超聲破碎、離心等方法獲取粗酶液。利用ni-nta親和層析柱根據(jù)6×his標(biāo)簽純化pl-ds11蛋白。

24、酶活性測(cè)定：采用dns法測(cè)定pl-ds11和wt果膠裂解酶的酶活性。結(jié)果顯示，pl-ds11的酶活性是wt的4.3倍以上。

25、4.?pl-ds11的應(yīng)用

26、pl-ds11作為一種高活性的果膠裂解酶，可在以下領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用：

27、食品加工：用于果汁澄清、果醬生產(chǎn)等，提升產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率。

28、飼料加工：由于植物性原料中含有果膠質(zhì)，它是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響飼料的利用率。飼料中添加果膠酶能有效的降解果膠質(zhì)，能有效促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分吸收，從而提高飼料的利用率。

29、紡織工業(yè)：應(yīng)用于生物酶退漿和生物拋光，提高紡織品的品質(zhì)。

30、造紙工業(yè)：用于紙漿的生物漂白，降低化學(xué)試劑的使用，減少環(huán)境污染。

31、本發(fā)明的最大特點(diǎn)是利用擴(kuò)散模型rfdiffusion，對(duì)果膠裂解酶序列進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，獲得了酶活性比野生型提高約4.3倍的突變體pl-ds11。pl-ds11與wt序列相比，共有91個(gè)氨基酸發(fā)生了替換。該果膠裂解酶在食品加工、飼料加工、紡織和造紙等工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。