本發(fā)明屬于生物，涉及一種脂肪組織細胞核提取液及其應用。

背景技術：

1、脂肪是一種高度活躍的內(nèi)分泌器官，根據(jù)其功能分為白色、棕色或米色，它在代謝中起著關鍵作用。然而，由于脂肪細胞充滿脂質(zhì)，且形態(tài)較大，與傳統(tǒng)的單細胞方法不兼容，因此缺乏較高分辨率的單細胞數(shù)據(jù)。

2、目前報道的脂肪組織細胞核提取的方法，適用的范圍有限，針對不同的物種及不同部位的脂肪，難以得到質(zhì)量較高的數(shù)據(jù)，且實驗缺乏較好的重復性，本發(fā)明公開的動物脂肪組織細胞核提取的方法，適用于多個物種，及不同部位的脂肪組織，可以極大滿足多種物種及不同部位的脂肪組織單細胞核提取。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種脂肪組織細胞核提取液及其應用。

2、為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種脂肪組織細胞核提取液，所述提取液包括蔗糖、hepes、無機鹽、表面活性劑、二硫蘇糖醇、rna酶抑制劑和水。

4、本發(fā)明所得脂肪組織細胞核提取液適用于不同物種及不同部位的脂肪，提取得到的細胞核狀態(tài)較好，完整性相對較高，表面活性劑、無機鹽、hepes的添加可以提升細胞核的提取效果，促進核的消化，保持核形態(tài)的完整。

5、優(yōu)選地，所述提取液以摩爾濃度計包括蔗糖0.1-0.4m、hepes?8-12mm、無機鹽8-15mm、二硫蘇糖醇100-300mm，以質(zhì)量百分含量計包括表面活性劑0.005-0.02％，以酶活計包括rna酶抑制劑400-600u/ml和水。

6、所述蔗糖的摩爾濃度可以選擇0.1m、0.12m、0.15m、0.18m、0.2m、0.22m、0.25m、0.28m、0.3m、0.32m、0.35m、0.38m、0.4m等，hepes的摩爾濃度可以選擇8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、10.5mm、11mm、11.5mm、12mm等，無機鹽的摩爾濃度可以選擇8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm等，二硫蘇糖醇的摩爾濃度可以選擇100mm、120mm、150mm、180mm、200mm、220mm、250mm、280mm、300mm等，表面活性劑的質(zhì)量百分含量可以選擇0.005％、0.008％、0.01％、0.012％、0.015％、0.018％、0.02％等，rna酶抑制劑的酶活可以選擇400u/ml、420u/ml、450u/ml、480u/ml、500u/ml、520u/ml、550u/ml、580u/ml、600u/ml等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

7、優(yōu)選地，所述無機鹽包括氯化鎂和氯化鉀。

8、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，無機鹽的添加可以促進核的消化，且氯化鎂和氯化鉀可以相互配合，二者缺一不可。

9、優(yōu)選地，所述氯化鎂和氯化鉀的摩爾比為(0.5-2.5):(8-12)。

10、其中(0.5-2.5)中的具體點值均可選擇0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.5等，(8-12)中的具體點值均可選擇8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

11、優(yōu)選地，所述表面活性劑包括igepal?ca-630。

12、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，表面活性劑的添加會提升細胞核的消化效果，表面活性劑種類的選擇會影響細胞核的提取效果，采用其他表面活性劑會導致核膜破損，igepal?ca-630的效果優(yōu)于其它表面活性劑。

13、第二方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)第一方面所述的脂肪組織細胞核提取液在制備脂肪組織細胞核提取產(chǎn)品中的應用。

14、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括試劑盒。

15、第三方面，本發(fā)明提供一種脂肪組織細胞核提取的方法，所述方法包括：

16、(1)將脂肪組織與第一方面所述的脂肪組織細胞核提取液混合，提取，得到第一混合液；

17、(2)將第一混合液過濾，離心，除去上層脂質(zhì)后重懸，得到重懸液；

18、(3)將重懸液離心，將所得沉淀使用重懸緩沖液重懸，即得。

19、本發(fā)明采用脂肪組織細胞核提取液結(jié)合特定的細胞核提取方法，提取得到的細胞核質(zhì)量更高。

20、優(yōu)選地，所述脂肪組織與脂肪組織細胞核提取液的比例為1g:(30-50)ml。

21、其中(30-50)中的具體點值均可選擇30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

22、優(yōu)選地，所述提取的溫度為0-4℃，時間為3-5min。

23、所述溫度可以選擇0℃、0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃等，時間可以選擇3min、3.2min、3.5min、3.8min、4min、4.2min、4.5min、4.8min、5min等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

24、優(yōu)選地，步驟(2)所述離心的轉(zhuǎn)速為800-1200g，時間為8-12min。

25、所述轉(zhuǎn)速可以選擇800g、820g、850g、880g、900g、920g、950g、980g、1000g、1020g、1050g、1080g、1100g、1120g、1150g、1180g、1200g等，時間可以選擇8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

26、步驟(3)所述離心的轉(zhuǎn)速為400-600g，時間為8-12min。

27、所述轉(zhuǎn)速可以選擇400g、420g、450g、480g、500g、520g、550g、580g、600g等，時間可以選擇8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

28、優(yōu)選地，所述重懸緩沖液以質(zhì)量百分含量計包括pbs?0.15-0.35％、pbsa?0.5-1.5％，以酶活計包括rna酶抑制劑30-60u/ml，以摩爾濃度計包括氯化鎂1.95-2.05mm和水。

29、rna酶抑制劑的酶活可以選擇30u/ml、32u/ml、34u/ml、36u/ml、38u/ml、40u/ml、42u/ml、44u/ml、46u/ml、48u/ml、50u/ml、52u/ml、54u/ml、56u/ml、58u/ml、60u/ml等，pbs的質(zhì)量百分含量可以選擇0.15％、0.18％、0.2％、0.22％、0.25％、0.28％、0.3％、0.32％、0.35％等，pbsa的質(zhì)量百分含量可以選擇0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，氯化鎂的摩爾濃度可以選擇1.95mm、1.96mm、1.97mm、1.98mm、1.99mm、2mm、2.01mm、2.02mm、2.03mm、2.04mm、2.05mm等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

30、相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下有益效果：

31、本發(fā)明所得脂肪組織細胞核提取液及細胞核的提取方法適用于不同物種及不同部位的脂肪，操作簡便，而且得到的細胞核狀態(tài)較好，完整性相對較高，滿足后期的rna-seq研究，有望滿足單細胞核測序(snrna-seq)甚至多組學研究。本發(fā)明為動物脂肪樣本細胞核的轉(zhuǎn)錄組研究奠定樣本制備基礎，具有重要意義。