本發(fā)明屬于基因工程，涉及水稻低鉀響應(yīng)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22在干旱脅迫的耐受性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、干旱是造成植物生長與作物產(chǎn)量急劇下降的最普遍的環(huán)境條件之一(zhu,2002)。在整個(gè)進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)獲得了一系列通過減少水分流失或增加吸水量來避免缺水的策略。即便如此，當(dāng)水分耗盡和組織脫水時(shí)其他防止細(xì)胞損傷的策略是必要的(verslueset?al.,2006)。在干旱等環(huán)境脅迫下，活性氧(ros)的積累是必須的(verslues?et?al.,2006)。在植物細(xì)胞中，ros如過氧化氫(h2o2)、羥基自由基和超氧化物是通過有氧代謝產(chǎn)生的，作為有害的氧衍生物，它們可以破壞脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(mittler?et?al.,2004)。為了減少氧化應(yīng)激，生物體已經(jīng)進(jìn)化出有效的抗氧化防御機(jī)制，涉及誘導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)基因(gasch?et?al.,2000；desikan?et?al.,2002)。植物細(xì)胞中細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持通常是通過ros清除系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，主要是在酶系統(tǒng)的輔助下，如過氧化氫酶(cat)和過氧化物酶(poxs)(mittler?et?al.,2004)。

2、鉀(k+)是植物中的主要陽離子，影響作物生產(chǎn)的各個(gè)方面，包括產(chǎn)量、對(duì)病原菌和非生物脅迫，包括對(duì)鹽分和干旱等的耐受性(ahmad?et?al.,2016b)。k+營養(yǎng)與水分穩(wěn)態(tài)和水分利用效率密切相關(guān)(kuchenbuch?et?al.,1986；tanguilig?et?al.,1987)。植物響應(yīng)干旱脅迫的一個(gè)重要機(jī)制是吸收k+等溶質(zhì)(andersen?et?al.,1992；wang?et?al.,2004；mahouachi?etal.,2006)。限制k+的損失有助于滲透調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞擴(kuò)張，確保適當(dāng)?shù)臍饪渍{(diào)節(jié)，并通過光合物轉(zhuǎn)運(yùn)幫助維持光合活性(and?kirkby,2010；et?al.,2014)，因此，在刺激條件下，k+輸運(yùn)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

3、kt/hak/kup轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被預(yù)測(cè)在維持k+穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用(et?al.,2002；gierth?et?al.,2005；nieves-cordones?et?al.,2007；fulgenzi?et?al.,2008；yanget?al.,2014；chen?et?al.,2015b；li?et?al.,2017)。在擬南芥中，kup6亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能通過平衡細(xì)胞生長和干旱脅迫中的k+穩(wěn)態(tài)，在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(osakabe?etal.,2013)。對(duì)滲透脅迫的感知可以通過損害hak5活性來觸發(fā)質(zhì)膜上的瞬時(shí)k+外流(braueret?al.,2016)。chen等人在水稻中發(fā)現(xiàn)oshak1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控水稻正向響應(yīng)干旱脅迫(chenet?al.,2017)。因此，對(duì)于kt/hak/kup轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如何通過影響k+來調(diào)控水稻對(duì)干旱脅迫的機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目是提供水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22在干旱脅迫的耐受性中的應(yīng)用，主要是過表達(dá)材料可以增加水稻在苗期和孕穗期對(duì)干旱脅迫的耐受，而敲除導(dǎo)致在苗期和孕穗期對(duì)干旱脅迫的耐受降低。

2、本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)實(shí)現(xiàn)：

3、水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22在調(diào)節(jié)水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性中的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22的cds序列如seqid?no.1所示(atgagcaggcgcatggcgaggggtgggcgcgcacgctgcgtctggccttccagtgcttcggcgtcctctacggcgacat?cggcacctccccactctacgtctactccaccaccttcgacggcggcatccgccacaccgacgacctcctcggcgtcctctccctcatcatctacagcttcctcctcttcaccatcatcaagtacgtctacatcgccctccgcgccaacgacgacggagacggcggcactttcgccctctactccctcatctcccgccacgccaaggtcagcctcgtccccaaccagcaggccgaggacgagctccacctccacatcagcaagtcctcctcgctccgccgcccctccgtccagcgcctcgcctccaccgccgaggagcgcgcccagtgggtcaaggacctcctcgagaacagccgccccgtccgcatctccctcttcctcctcaccatcctcgccaccgccatggtcatcagcgacgcctgcctcacgcccgccatctccgtcctctccgccgtcggtggcctcaaggacaaggcgccacacctcaacactggtggtgtgggtgacggtgggcatcctggtgatgctgttcgcggtgcagaggttcgggacagacaaggtggggtacctgttcgcccccgtcgttttgctgtggctcctcctcatcggcggcgtcggggtgtacaacctcgccgcccacgacgtcggcgtcctccgcgccttcaacccaaagtacatcctcgactacttccgccgcaacggacgccacggctgggtctccctcggcggcgtcctcctctgcttcaccggcaccgaggcactcttcgccgacctcggctgcttcagcatccgctccatccagctcagcttcgccttcggcctcgtcccggccgtgctgctggcctacgccgggcaggccgcctacctgcgcgtgtacccggaccacgtcggcgacgccttctacgcgtcgacgccgcaggtgctgttctggccaaccctggtgctggcgctggcggcgtccgtggtgggcagccaggccatgatctcctgcgccttcgccaccatctcccactcgcaggccatggggtgcttcccgcgcgtgaaggtggtgcacacgtccaggcagtaccaggggcaggtgtacatcccggagatcaacctcctgctgggcgcggccgcctgtgtggtgacggtggcggcgcgggacacggtggtgatcggcgaggcgcacggcatctgcgtggtgctggtgatgctcatcaccacgctgctgctgacggtggtgatggtgctggtgtggcgggtgaacatcgggtgggtgctggtgttcgcctgcgtcttcgcctccaccgagtcggtgtacctgacgtcggtgctctacaagttcgcgcacggcgggtacataccggtggccatgtcggcggtgctgatgggggtgatgggggtgtggcactacgtgcacgtcaggaggtacaagtacgagatggagaggacggtgtcgacggagagggtgagggagcttgtgtctcggagggagctgcagagggtgcccggtgtggggctcttctacacggacctcgtgcaggggatccccccggtgttccctcacctcatcgacaagatcccctccatccacaccgtcctcctcttcgtctccgtcaagcacctccccgtcccgcacgtcgacccctcggagcgcttcctcttccgccaggtggagccgcaggagcacaagctcttccgctgcgtcgcgcgctacggctaccgcgaccgcctcgaggacgcccgcgacttcgtcgccaacctcgtggaaaggctgcagtactacgtgcgggacgtcaacctgtacggcgccgccgccaataataaggtgagctacccgagctctcgttgcgacagcatgggcatacccaagtcggcttcctacgcggagaggctgcagctgcagagggccaggtcggtggccatgctccactcgcattctcagcatcagcaacagcctctgcctcagcagctgggccagctgcttcagtactcggcatccacgggagagcagcagcgccgctccgtttacgcggaggagatgcttactccggcggagtcgttctcggagatggggacgatggcggcgagcgggcggcagctgatggcggtggcggtgaagatgagcctggaggagatggcgcggatcgaggaggagcagcggttcatacagagggagatggagaaaggggtggtgttcatcctcggggagagcgaggtggtggcgaggcctcactcctccctcctcaagaagctcgtcgtcaactacgcctactccttcctccgccgcaactgcaggcagggcgacaagatgctcgccatccccaggagccaactcctcaaagtcggcatgtcctacgagatctga)。

4、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，過表達(dá)所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22會(huì)增強(qiáng)水稻對(duì)干旱脅迫的耐受。優(yōu)選自如下任意一項(xiàng)或多項(xiàng)：

5、(1)增加水稻苗期對(duì)干旱脅迫的耐受；

6、(2)提高水稻孕穗期在干旱脅迫下莖和葉鞘的鉀含量；

7、(3)提高水稻孕穗期在干旱脅迫下的相對(duì)產(chǎn)量。

8、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，敲除所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22會(huì)降低水稻對(duì)干旱脅迫的耐受。

9、含有所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22的重組表達(dá)載體。

10、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的重組表達(dá)載體是將所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22插到出發(fā)載體ptck303的saci和bamhi酶切位點(diǎn)所得。

11、所述的重組表達(dá)載體在提高水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性中的應(yīng)用。

12、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的重組表達(dá)載體在提高水稻在干旱脅迫下相對(duì)產(chǎn)量，進(jìn)而提高水稻的抗干旱能力中的應(yīng)用。

13、敲除所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22在降低水稻對(duì)干旱脅迫耐受中的應(yīng)用。

14、敲除所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22在降低干旱脅迫下相對(duì)產(chǎn)量，最終導(dǎo)致水稻對(duì)干旱脅迫的高敏感中的應(yīng)用。

15、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，敲除所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22的敲除載體為以pos-sgrna載體為基礎(chǔ)載體，針對(duì)所述的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak?22的靶點(diǎn)序列t1(seq?id?no.2：cccactctacgtctactcca)和t2(seq?idno.3：ctgttcgcgg?tgcagaggtt)設(shè)計(jì)并合成引物，引物退火后插入基礎(chǔ)載體的bsai酶切位點(diǎn)之間得到u3::spac?er表達(dá)載體。u3::spacer表達(dá)載體質(zhì)粒和ph-ubi-cas9-7表達(dá)載體質(zhì)粒再通過gateway反應(yīng)后得到含有u3::spacer和ubi：：cas9雙表達(dá)的表達(dá)載體。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、1.本發(fā)明中，世界上首次發(fā)現(xiàn)由水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22構(gòu)建的重組表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)染到野生型水稻日本晴(oryzasativa.ssp.

18、cv.japonica)中，我們發(fā)現(xiàn)oshak22過表達(dá)材料苗期對(duì)干旱脅迫的耐受與野生型水稻相比顯著提高。

19、2.本發(fā)明中的oshak22基因來源于水稻，構(gòu)建的水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因oshak22植物表達(dá)載體可以直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得可以增強(qiáng)水稻對(duì)干旱脅迫耐受的新種質(zhì)。

20、3.本發(fā)明中的oshak22基因過表達(dá)后可以增強(qiáng)水稻苗期和孕穗期對(duì)干旱脅迫的耐受，通過提高干旱脅迫下葉鞘對(duì)鉀的吸持，最終提高作物的相對(duì)產(chǎn)量。