本發(fā)明涉及雜交種子純度鑒定領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定翠錦白菜種子純度的ssr引物及方法。

背景技術(shù)：

1、大白菜(brassica?campestris?l.)是十字花科蕓薹屬中一類重要蔬菜，又名結(jié)球白菜、包心白菜等。起源于我國，栽培歷史悠久，品種類型豐富多樣，具有產(chǎn)量高、耐儲運(yùn)性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)、營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)，是我國栽培面積和消費(fèi)量最大的蔬菜作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和食用價值。

2、優(yōu)質(zhì)的品種是保障大白菜正常生產(chǎn)和供應(yīng)的關(guān)鍵，而種子純度是品種優(yōu)劣的重要評判標(biāo)準(zhǔn)。目前，大白菜多采用自交不親和系進(jìn)行生產(chǎn)雜交種，在制種的過程中，存在自交種、外來花粉混入或制種距離不足等因素導(dǎo)致雜交種純度不達(dá)標(biāo)的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響種子的質(zhì)量。因此，雜交種種子純度越來越受到種企和菜農(nóng)的重視。而目前大白菜種子純度的鑒定方法仍采用傳統(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)鑒定法，采用田間區(qū)域性種植，以發(fā)育成植株為鑒定對象，根據(jù)植株在生育期間的形態(tài)特征和生物學(xué)特性為依據(jù)進(jìn)行鑒定。存在周期長、環(huán)境因素影響大、費(fèi)工占地等缺點(diǎn)，易導(dǎo)致與銷售旺季錯峰，所導(dǎo)致的種子庫存積壓，致使育種企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

3、翠錦白菜，是無錫普威農(nóng)業(yè)科技有限公司自主培育的雜交一代新中型白菜品種，單球重1-1.8kg，圓筒形，外葉深綠色，葉球合抱，金黃色內(nèi)芯，葉脈薄，水分含量低，口味極佳，品質(zhì)高，低溫條件下球內(nèi)葉分化快，抗病性強(qiáng)，耐熱性好。為了培育優(yōu)質(zhì)的翠錦白菜，需要對翠錦白菜的種子純度進(jìn)行鑒定，種子純度是翠錦白菜種子質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。該品種之前一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度，隨著播種面積和種子需求量的增加，急需探索出一種快捷、準(zhǔn)確且不易受外界因素影響的純度鑒定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述存在的問題，本發(fā)明提供的一種鑒定翠錦白菜種子純度的ssr引物及方法，能夠解決現(xiàn)有技術(shù)一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度而導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出翠錦白菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供的一種鑒定翠錦白菜種子純度的ssr引物，包括上游引物rapa11-f和下游引物rapa11-r，其中，

4、所述上游引物rapa11-f為：gcgtaggtccgatgtctctg；

5、所述下游引物rapa11-r為：gcacccgcatctaacagaga。

6、本發(fā)明提供的一種鑒定翠錦白菜種子純度的方法，包括：

7、(1)提取待測樣品翠錦白菜雙親及雜交種f1的基因組dna；

8、(2)利用權(quán)利要求1所述的ssr引物對所述步驟(1)中翠錦白菜雙親及雜交種f1的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

9、(3)采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對所述步驟(2)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，進(jìn)行銀染顯色；

10、(4)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算翠錦白菜雜交種純度，種子純度(％)＝(總檢測種子粒數(shù)-假雜種)/總檢測種子粒數(shù)×100％；

11、其中所述步驟(2)中采用10μl的pcr反應(yīng)體系：2×taq?master?mix?5μl，10μm的所述上游引物rapa11-f和所述下游引物rapa11-r各0.5μl，基因組dna?1.5μl，ph＝8.0、0.1μm的tris-hcl?2.5μl；

12、pcr反應(yīng)程序采用touch-down，共有六個階段分別為：

13、第一階段：95℃預(yù)變性5min；

14、第二階段：94℃變性45s；68-58℃進(jìn)行6個循環(huán)的退火，每個循環(huán)降低2℃，每次1min；72℃延伸1min；

15、第三階段：94℃變性30s；58-50℃進(jìn)行8個循環(huán)的退火，每個循環(huán)降低1℃，每次1min；72℃延伸1min；

16、第四階段：94℃變性30s；50℃退火30s；72℃延伸1min；將此階段進(jìn)行20個循環(huán)；

17、第五階段：72℃延伸7min；

18、第六階段：4℃保溫。

19、本發(fā)明提供的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，優(yōu)選地，所述步驟(1)具體如下：取3mm2子葉置于2ml的離心管內(nèi)；加入1顆直徑3mm的鋼珠，同時加入300μl的dna提取液；置于研磨機(jī)上在50hz的頻率下，研磨15s；10000rpm離心1min，取出備用。

20、本發(fā)明提供的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，優(yōu)選地，所述步驟(3)中采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：每個點(diǎn)樣孔加1.5μl?pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳，待電泳指示劑距凝膠中下部時停止電泳；

21、取下膠板，倒入染色液，置于搖床上緩慢搖動3min；

22、將染色液倒出，加入少量蒸餾水快速清洗3次，再倒入顯色液進(jìn)行顯色，緩慢搖動至條帶清洗，用蒸餾水漂洗；

23、其中，染色液總量為1000ml，包括1.2g的agno3，其余由蒸餾水補(bǔ)足；顯色液總量為1000ml，包括15g的naoh和15ml的甲醛，其余由蒸餾水補(bǔ)足。

24、本發(fā)明提供的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，優(yōu)選地，所述步驟(4)中計(jì)算翠錦白菜雜交種純度：將所述步驟(3)得到的凝膠放置于膠片觀察燈上，拍照統(tǒng)計(jì)結(jié)果，雜交種同時具有父本和母本的特異帶型的為真正的雜交種，缺少兩親本中任意一條特征帶或者為非親本特異條帶的均為假雜種。

25、上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)或者有益效果：

26、本發(fā)明提供的鑒定翠錦白菜種子純度的ssr引物及方法，通過篩選并使用在翠錦白菜雜交種中能同時展現(xiàn)出父本和母本的特異性條帶、具有較強(qiáng)特異性的引物，能夠解決現(xiàn)有技術(shù)一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度而導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出翠錦白菜雜交種的種子純度，具有快速、穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，可以高效地檢測翠錦白菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定翠錦白菜種子純度的ssr引物，其特征在于，包括上游引物rapa11-f和下游引物rapa11-r，其中，

2.一種鑒定翠錦白菜種子純度的方法，其特征在于，包括：

3.如權(quán)利要求2所述的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體如下：取3mm2子葉置于2ml的離心管內(nèi)；加入1顆直徑3mm的鋼珠，同時加入300μl的dna提取液；置于研磨機(jī)上在50hz的頻率下，研磨15s；10000rpm離心1min，取出備用。

4.如權(quán)利要求2所述的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：每個點(diǎn)樣孔加1.5μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳，待電泳指示劑距凝膠中下部時停止電泳；

5.如權(quán)利要求2所述的鑒定翠錦白菜種子純度的方法，其特征在于，所述步驟(4)中計(jì)算翠錦白菜雜交種純度：將所述步驟(3)得到的凝膠放置于膠片觀察燈上，拍照統(tǒng)計(jì)結(jié)果，雜交種同時具有父本和母本的特異帶型的為真正的雜交種，缺少兩親本中任意一條特征帶或者為非親本特異條帶的均為假雜種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供的一種鑒定翠錦白菜種子純度的SSR引物及方法，涉及雜交種子純度鑒定領(lǐng)域，通過篩選并使用在翠錦白菜雜交種中能同時展現(xiàn)出父本和母本的特異性條帶、具有較強(qiáng)特異性的引物，能夠解決現(xiàn)有技術(shù)一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度而導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出翠錦白菜雜交種的種子純度，具有快速、穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，可以高效地檢測翠錦白菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：孫中偉,呂晨晨,胡倩梅,宋芃垚,丁郅真,何春霖,李潔,徐友蓮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：無錫普威農(nóng)業(yè)科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9