本發(fā)明專利涉及一種cas12f核酸酶突變體、其應(yīng)用及試劑盒，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、crispr全稱是clusteredregularly?interspaced?shortpalindromic?repeats(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列)，即很多條相同的小段，然后把它們均勻地插入了一段雜亂排列的dna一樣。這些序列稱為重復(fù)序列(repeat)，而把它們隔開的雜亂排列的dna稱為間隔序列(spacer)。而cas的全稱是crispr?associated(crispr關(guān)聯(lián))，其與crispr序列一起構(gòu)成了crispr/cas系統(tǒng)。crispr/cas系統(tǒng)在疾病模型建立、抗癌藥物研制、干細(xì)胞治療等生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。

2、crispr/cas系統(tǒng)中，研究和使用最多的cas效應(yīng)蛋白是cas9，但是，其因較大的分子尺寸(超過1000個氨基酸)而難以被腺相關(guān)病毒(aav)載體進(jìn)行高效遞送，從而限制了其在基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)的最大承載量是4700個核苷酸，比編碼釀膿鏈球菌(streptococcus?pyogenes)cas9的基因(4200個核苷酸)長不了多少，導(dǎo)致沒有空間組裝其他調(diào)控元件。

3、為此，研究人員積極尋找“體格”比較小，但仍能發(fā)揮“剪刀”功能的cas效應(yīng)蛋白。其中最緊湊的一類crispr效應(yīng)核酸酶cas12f(400-700個氨基酸)因其較小的分子量備受關(guān)注。cas12f是依賴于crrna和tracrrna共同介導(dǎo)的(或融合后的sgrna單獨介導(dǎo)的)dna核酸內(nèi)切酶，能以pam依賴的方式特異地剪切靶標(biāo)dsdna，使dna雙鏈斷裂并生成黏性末端。目前，關(guān)于核酸酶cas12f研究相對較少，本申請通過對其進(jìn)行突變，以期望進(jìn)一步提高其性能。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種cas12f核酸酶突變體，具有更高的體外切割活性。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種cas12f核酸酶突變體，為如下a1-a3酶突變中任一所述的蛋白質(zhì)：

4、a1：在氨基酸序列如seq?id?no.2所示的cas12f核酸酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下位點中的一個或多個任意突變：115、119、364、401、447；這些位點都是cas12f核酸酶與sgrna/dsdna結(jié)合區(qū)域的位點，優(yōu)化這些位點氨基酸殘基的電荷，從野生型氨基酸殘基的中性或酸性突變?yōu)閴A性或中性，提高兩者的結(jié)合能力。

5、a2：將a1所示的氨基酸序列經(jīng)過除前述突變以外的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的切割效率的蛋白質(zhì)；

6、a3：與a1的蛋白質(zhì)具有90％以上的序列同一性，或至少有95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％序列同一性，且切割效率與a1的蛋白質(zhì)基本相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。

7、優(yōu)選的，所述的突變選自q115l、e119l、i364k、t386k、e393a、e401a或e447k中的一個或多個組合。這些位點都是cas12f核酸酶與sgrna/dsdna結(jié)合區(qū)域的位點，優(yōu)化這些位點氨基酸殘基的電荷，從野生型氨基酸殘基的中性或酸性突變?yōu)閴A性或中性，提高兩者的結(jié)合能力。

8、優(yōu)選的，還包括標(biāo)簽，所述標(biāo)簽用于分離純化和/或追蹤cas12f核酸酶的功能域、肽或蛋白。更優(yōu)選的，所述標(biāo)簽為組氨酸(his)標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、流感血凝素(ha)標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、vsv-g標(biāo)簽、硫氧還蛋白(trx)標(biāo)簽。熒光蛋白,例如綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)、青色熒光蛋白(cfp)、藍(lán)色熒光蛋白(bfp)、hcred和dsred；谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、辣根過氧化物酶(hrp)或熒光素酶等報告蛋白。

9、本發(fā)明中的突變的描述是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)同的突變描述，以其中一個位點的突變示例，q115l，指的是seq?id?no:2所示的氨基酸序列的第115位的谷氨酰胺(q)突變?yōu)榱肆涟彼?l)，即第115位的谷氨酰胺(q)被亮氨酸(l)替代。

10、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法計算百分比序列同一性，例如使用blosum62?matrix，參照henikoff等人在pnas,89(22):10915-10919(1992)中描述的方法。

11、上述的cas12f核酸酶突變體的編碼基因。

12、上述的cas12f核酸酶突變體的表達(dá)載體或者宿主菌。

13、上述的cas12f核酸酶突變體在體外進(jìn)行基因編輯中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還公開了一種組合物或試劑盒，含有上述的cas12f核酸酶突變體。

15、本發(fā)明還公開了一種基因編輯試劑盒，含有上述的cas12f核酸酶突變體。

16、本發(fā)明還公開了一種切割靶核酸的方法，使靶核酸與上述的cas12f核酸酶突變體、組合物或試劑盒接觸。

17、本發(fā)明在野生型cas12f核酸酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，獲得的突變體相較于野生型而言，切割效率明顯提升，平均提升1.3-2.2倍不等，更適合進(jìn)行基因編輯，提升編輯效率。

技術(shù)特征：

1.一種cas12f核酸酶突變體，其特征在于，為如下a1-a3中任一所述的蛋白質(zhì)：

2.一種cas12f核酸酶突變體，其特征在于：為如下b1-b3中任一所述的蛋白質(zhì)：

3.權(quán)利要求1或2所述的cas12f核酸酶突變體，其特征在于，還包括標(biāo)簽，所述標(biāo)簽用于分離純化和/或追蹤cas12f核酸酶的功能域、肽或蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的cas12f核酸酶突變體，其特征在于，所述標(biāo)簽為his標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、?flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、vsv-g標(biāo)簽、trx標(biāo)簽、熒光蛋白、gst、hrp或熒光素酶。

5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體的編碼基因。

6.權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體的表達(dá)載體或者宿主菌。

7.權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體在體外基因編輯中的應(yīng)用。

8.一種組合物或試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體。

9.一種基因編輯試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體或權(quán)利要求5所述的編碼基因。

10.一種切割靶核酸的方法，其特征在于使靶核酸與權(quán)利要求1-4中任一項所述的cas12f核酸酶突變體、權(quán)利要求8所述的組合物或試劑盒接觸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種Cas12f核酸酶突變體，在氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的Cas12f核酸酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下位點中的一個或多個任意突變：115、119、364、401、447。還公開了其編碼基因、表達(dá)載體、宿主菌、試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明在野生型Cas12f核酸酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，獲得的突變體相較于野生型而言，切割效率明顯提升，平均提升1.3?2.2倍不等，更適合進(jìn)行基因編輯，提升編輯效率。

技術(shù)研發(fā)人員：劉想,劉雪,唐瓊衛(wèi)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鎂孚泰生物科技（上海）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9