本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及一種口蹄疫病毒o型型內(nèi)廣譜中和性豬源單克隆抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、口蹄疫(foot-and-mouth?disease,fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease?virus,fmdv)引起的一種高度傳染性動物疾病，具有高度的變異性和廣泛的宿主譜，能夠感染包括牛、豬、羊等在內(nèi)的多種偶蹄動物，對畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。fmdv屬于小rna病毒科，具有七個血清型(a、o、c、asia1、sat1、sat2、sat3)，其中o型血清型是全球范圍內(nèi)最為流行和廣泛分布的類型，其毒株的頻繁變異和抗原位點的復(fù)雜性，使得fmd的防控成為全球動物衛(wèi)生領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。自20世紀以來，o型fmdv已成為全球范圍內(nèi)最常見且分布最廣泛的血清型。從歐洲、亞洲到非洲，o型fmdv的足跡幾乎遍及所有受fmd影響的國家和地區(qū)。其高傳染性、快速的傳播速度以及對多種宿主的適應(yīng)性，使其成為全球動物衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點。近年來，o型fmdv的跨洲際傳播事件頻發(fā)，如2018年非洲豬瘟病毒(asfv)與o型fmdv在亞洲地區(qū)的重疊流行，進一步加劇了疫情的復(fù)雜性，對全球動物健康和經(jīng)濟安全構(gòu)成了嚴重威脅。

2、o型fmdv的遺傳變異是其流行性的重要驅(qū)動因素。fmdv屬于正鏈rna病毒，由于缺乏校正酶的作用，rna復(fù)制過程中易發(fā)生錯誤，導(dǎo)致病毒基因組的頻繁變異。o型fmdv的變異不僅體現(xiàn)在血清型內(nèi)，也表現(xiàn)為血清型間的跨型變異。近年來，o型fmdv的新型變異毒株不斷涌現(xiàn)，如2010年在中東地區(qū)首次報告的o/me-sa/ind-2001毒株，以及隨后在亞洲和非洲多國出現(xiàn)的o/ind/2010-like和o/mya-98-like等變異毒株，這些新型變異毒株的出現(xiàn)，對fmd的診斷與防控帶來了新的難題。

3、fmdv的抗原性是其感染和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。o型fmdv的抗原位點主要位于其病毒衣殼蛋白vp1、vp2和vp3上，尤其是vp1的g-h環(huán)區(qū)域，被認為是主要的中和抗原位點。近年來，通過x射線晶體學、冷凍電鏡等技術(shù)，科學家們對o型fmdv的抗原位點結(jié)構(gòu)進行了深入解析，揭示了抗原位點的三維結(jié)構(gòu)特征及其與抗體的相互作用機制，為設(shè)計高效疫苗和開發(fā)診斷試劑提供了重要的分子基礎(chǔ)。此外，抗原位點的變異與病毒的免疫逃避機制密切相關(guān)，深入理解抗原位點的變異特征，對于預(yù)測病毒進化趨勢、評估疫苗免疫效果具有重要意義。利用生物信息學技術(shù)和分子生物學手段，研究人員對fmdv?o型毒株的抗原位點進行了深入解析。通過序列比對、結(jié)構(gòu)預(yù)測和抗原表位預(yù)測等方法，揭示了vp1蛋白中多個關(guān)鍵的中和性抗原位點。這些位點不僅是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，也是疫苗設(shè)計和優(yōu)化的重要靶點。例如，o/panasia毒株的vp1蛋白在gh環(huán)和c末端存在兩個主要的線性表位，這些表位具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效的中和抗體。通過進一步篩選和優(yōu)化這些表位，可以開發(fā)出具有更強免疫保護力的多肽疫苗或基因工程疫苗。除了抗原位點2外，根據(jù)使用單克隆抗體選擇的逃逸突變型fmdv的序列分析，定義了fmdv血清型o的vp2衣殼蛋白上的其他表位。已鑒定的vp2中和表位包括βb-βc環(huán)的殘基68和74、βb-βc環(huán)附近的殘基79、βe-βf環(huán)的殘基133和134以及βh-βi環(huán)的殘基188和191。此外，vp2?n端的非中和保守表位(殘基1-5)也被鑒定出來，并用于開發(fā)fmdv的通用診斷檢測。

4、單克隆抗體(monoclonal?antibody,mab)是現(xiàn)代免疫學的重要工具，具有高特異性、高親和力的特點，在fmd的研究與防控中發(fā)揮著不可替代的作用。針對o型fmdv的單克隆抗體，不僅可用于病毒的快速檢測與鑒定，也是研究病毒抗原性、免疫逃逸機制的重要工具。此外，單克隆抗體在fmd疫苗的研發(fā)中也展現(xiàn)出巨大潛力，通過篩選與病毒抗原位點高度親和的mab，可以指導(dǎo)疫苗抗原的設(shè)計，提高疫苗的免疫效果。近年來，基于mab的fmd診斷試劑盒和治療性抗體的研發(fā)取得了顯著進展，為fmd的精準防控提供了新的手段。

5、o型fmdv的全球流行性、毒株的頻繁變異以及抗原位點的復(fù)雜性，使得fmd的防控成為一項長期而艱巨的任務(wù)。單克隆抗體作為現(xiàn)代免疫學的利器，在fmd的研究與防控中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。面對o型fmdv的全球流行和復(fù)雜變異，深入解析其遺傳變異特征、抗原位點結(jié)構(gòu)與功能，以及開發(fā)高效特異的單克隆抗體，是防控策略的重要方向。新一代抗體工程技術(shù)如雙特異性抗體和抗體-藥物偶聯(lián)物(adcs)等將拓展應(yīng)用，結(jié)合人工智能和大數(shù)據(jù)分析，推動抗體設(shè)計的智能化，為全球動物健康和經(jīng)濟安全保駕護航。

6、病毒感染后誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體包括中和抗體和非中和抗體。中和抗體和非中和抗體的區(qū)別在于由不同的抗原所誘生。中和抗體由病毒表面抗原誘生。而非中和抗體由病毒內(nèi)部抗原或表面非中和抗原所誘生。由于中和抗體是在病毒進入細胞之前破壞病毒的，現(xiàn)有的疫苗如麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗，都是使接種者產(chǎn)生中和抗體以抵御病毒的?？贵w在醫(yī)療實踐中應(yīng)用甚為廣泛。如用于疾病的預(yù)防、診斷和治療方面都有一定的作用。當然，“非中和抗體”并非沒有用處，它們也可以介導(dǎo)病毒進入巨噬細胞。然而“非中和抗體”的作用非常復(fù)雜，它們也可能引起人體其他的不良免疫反應(yīng)，比如肺部免疫損傷，比如抗原抗體復(fù)合物沉淀引發(fā)的一些問題等等。

7、兩者究其開發(fā)難度來說，成功篩選出特異性強、中和力度高的中和抗體的難度遠大于篩選出非中和抗體。

8、本領(lǐng)域中關(guān)于口蹄疫病毒的單抗研究主要集中在申請人中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，該申請人為本技術(shù)人的聯(lián)合研發(fā)單位。在前期研究中，主要集中在非中和抗體的研究，有效的中和抗體的研究一直沒能研發(fā)成功。具體可見如下文獻：

9、cn118580346a一種口蹄疫病毒廣譜非中和抗體及其在制備增強誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的試劑中的應(yīng)用；

10、口蹄疫病毒o型和a型交互反應(yīng)性單克隆抗體的篩選與鑒定，中國獸醫(yī)科學，周莎莎等著；

11、口蹄疫病毒vp2蛋白特異性單克隆工程抗體的表達與活性鑒定，中國獸醫(yī)科學，王省等著；

12、上述三種方案都開發(fā)出了能夠和特異性o型和/或a型血清型口蹄疫病毒結(jié)合的單克隆抗體，分別為豬源、牛源的單克隆抗體，但是這些抗體普遍沒有中和能力。

13、在前期研究中，我們免疫了豬和牛，共得到70多株單克隆抗體，但是都沒有明顯的中和能力。

14、本案解決的技術(shù)問題是：如何開發(fā)出一種針對o型血清型口蹄疫病毒具有高度特異性和中和能力的單克隆抗體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種口蹄疫病毒o型型內(nèi)廣譜中和性豬源單克隆抗體，該單克隆抗體識別的抗原關(guān)鍵氨基酸殘基為vp2蛋白77位，該位點位于結(jié)構(gòu)蛋白vp2?b-c環(huán)，為構(gòu)象性表位，其不與a型抗原反應(yīng)，是一株型內(nèi)廣譜中和抗體，并表現(xiàn)出較強的中和效力(ic50＜5μg·ml-1)。

2、同時，本發(fā)明還提供了該單克隆抗體的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的具體方案為：

4、一種口蹄疫病毒o型型內(nèi)廣譜中和性豬源單克隆抗體，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、同時，本發(fā)明還公開了采用如上所述的單克隆抗體制備疫苗的用途。

6、在上述的用途中，所述疫苗為用于預(yù)防和治療o型血清型口蹄疫病毒感染的疫苗。

7、此外，本發(fā)明還公開了采用如上所述的單克隆抗體制備用于檢測o型血清型口蹄疫病毒的試劑盒的用途。

8、最后本發(fā)明還公開了一種疫苗，含有如上所述的單克隆抗體。

9、以及，一種試劑盒，包括如上所述的單克隆抗體。

10、本技術(shù)的有益效果是：

11、本發(fā)明通過純化o型fmdv?mya98譜系當前流行毒株hnny/2022病毒粒子及進行生物素標記制備誘餌抗原，成功分選fmdv?o型抗原免疫豬的抗原特異性b細胞，測序獲得庫容量為3189對bcr序列的特異性抗體庫，其中igg共2020條，占配對bcr的63％。

12、本發(fā)明經(jīng)過對抗體特性分析，篩選并成功表達1株單克隆抗體pony-10。ifa、間接elisa和病毒微量中和實驗結(jié)果共同指向該抗體對o型毒株的特異性反應(yīng)。pony-10對fmdvo型血清型各譜系代表毒株展現(xiàn)出特異性中和作用，并表現(xiàn)出強中和效力，對a型抗原不反應(yīng)，無中和作用。

13、pony-10識別的抗原關(guān)鍵氨基酸殘基為vp2蛋白77位，該位點位于結(jié)構(gòu)蛋白vp2?b-c環(huán)，為構(gòu)象性表位，屬于抗原位點2。pony-10的反應(yīng)性和中和特性是基于o型血清型內(nèi)的各毒株，不與a型抗原反應(yīng)，是一株型內(nèi)廣譜中和抗體。中和性單克隆抗體的研究和應(yīng)用是現(xiàn)代醫(yī)學和生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要分支，它們在提高疾病治療效率、預(yù)防感染和促進新藥開發(fā)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。