本發(fā)明屬于細(xì)胞器分離，具體涉及一種基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法。

背景技術(shù)：

1、過氧化物酶體由j.?rhodin（1954年）首次在鼠腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是一種具有異質(zhì)性的細(xì)胞器，在不同生物及不同發(fā)育階段有所不同；直徑約0.2-1.5μm，通常為0.5μm，呈圓形，橢圓形或啞呤形不等，由單層膜圍繞而成；共同特點(diǎn)是內(nèi)含一至多種依賴黃素（flavin）的氧化酶和過氧化氫酶（標(biāo)志酶），已發(fā)現(xiàn)40多種氧化酶，如l–氨基酸氧化酶，d–氨基酸氧化酶等等，其中尿酸氧化酶（urate?oxidase）的含量極高，以至于在有些種類形成酶結(jié)晶構(gòu)成的核心?？茖W(xué)研究中對于過氧化物酶體及其中微量物質(zhì)的研究通常需要將其從胞漿中分離進(jìn)行詳細(xì)研究，目前過氧化物酶體的分離技術(shù)主要原理是通過超速離心實(shí)現(xiàn)。

2、現(xiàn)有的基于超速離心的分離方法，雖然能分離出大多數(shù)過氧化物酶體，但需要大量的細(xì)胞以及超速離心之前進(jìn)行細(xì)胞膜破碎，耗時較長且精密度不高；過氧化物酶體分離試劑盒步驟繁瑣且價格較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，本方法簡單、快速、準(zhǔn)確度與靈敏度高、特異性強(qiáng)，試劑消耗量小，可用于少量細(xì)胞過氧化物酶體的分離。

2、本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為：

3、一種微流控芯片，包括芯片主體，芯片主體設(shè)有微流道，微流道包含有依次連通的裂解模塊、孵育模塊和分選模塊；

4、裂解模塊配置有第一入口，用于細(xì)胞懸液進(jìn)液；裂解模塊配置有第一流道，用于連接第一入口與孵育模塊，第一流道的內(nèi)部設(shè)有若干縮口；

5、孵育模塊的起始端配置有第二入口，用于磁珠顆粒的進(jìn)樣；磁珠的磁珠表面包被有抗體、抗原或二抗；

6、分選模塊配置有第一出口和第二出口用于出液；分選模塊配置有磁體，用于吸附磁珠，磁體設(shè)于分選模塊遠(yuǎn)離第一出口的一側(cè)。

7、進(jìn)一步的，第一出口與第二出口成y型分布。

8、進(jìn)一步的，第一流道內(nèi)的若干縮口陣列設(shè)置，并且靠近第一入口的縮口尺寸大于靠近孵育模塊的縮口尺寸。

9、進(jìn)一步的，多個第一流道并列設(shè)置。

10、進(jìn)一步的，孵育模塊包括第二流道，第二流道彎曲設(shè)置。

11、優(yōu)選的，芯片主體包括設(shè)于底板和蓋板，底板載玻片，蓋板為pdms層，微流道設(shè)于蓋板的內(nèi)部；第一入口、第二入口、第一出口、第二出口均與外界連通。

12、優(yōu)選的，裂解模塊中并列設(shè)置多個第一流道，第一流道內(nèi)部縮口的尺寸范圍為1.5-30μm，并且沿細(xì)胞懸液流向設(shè)置的若干縮口尺寸逐漸減小。

13、基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，采用上述微流控芯片，包括以下步驟：

14、s1.?加樣：細(xì)胞懸液經(jīng)第一入口進(jìn)入微流道，細(xì)胞懸液在流經(jīng)第一流道內(nèi)的若干縮口時，細(xì)胞裂解；分離系統(tǒng)懸液經(jīng)第二入口進(jìn)入微流道，分離系統(tǒng)懸液中含有包被有抗原、抗體或二抗的磁珠；

15、s2.?反應(yīng)：自第一流道進(jìn)入微流道的細(xì)胞裂解液與自第二入口進(jìn)入微流道的分離系統(tǒng)懸液在孵育模塊匯合，形成混合液，磁珠表面的抗原、抗體或二抗與細(xì)胞裂解液中的物質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；

16、s3.?分選：混合液進(jìn)入分選模塊，磁珠以及附于其表面的結(jié)合物在磁體的作用下經(jīng)由第二出口流出，混合液中的其余成分經(jīng)由第一出口流出；

17、s4.?洗脫：收集第二出口所得磁珠，并采用生物素對其中的磁珠進(jìn)行競爭性洗脫，將磁珠與細(xì)胞裂解液中的物質(zhì)分離。

18、優(yōu)選的，步驟s1中，磁珠為超順磁性顆粒，材質(zhì)為三氧化二鐵和/或四氧化三鐵；磁珠的粒徑為30-150μm。

19、優(yōu)選的，磁珠的表面結(jié)合有pmp70抗體。

20、優(yōu)選的，表面結(jié)合有pmp70抗體的磁珠的制備包括以下步驟：

21、strep-tag?ii與抗pmp70抗體結(jié)合，再與pmp70抗體結(jié)合，形成strep-tag?ii-抗抗體-抗體復(fù)合物；

22、以包被strep?-?tactin磁珠作為固體底物，與strep-tag?ii-抗抗體-抗體復(fù)合物發(fā)生蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，獲得表面結(jié)合有pmp70抗體的磁珠。

23、優(yōu)選的，步驟s1中，細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度為1×106-1×108個細(xì)胞/ml。

24、優(yōu)選的，步驟s1中，分離系統(tǒng)懸液包括緩沖溶液ⅰ，分離系統(tǒng)懸液中磁珠的濃度范圍為5-20%（v/v），緩沖溶液ⅰ以pbs作為溶劑，并含有pmsf?0.5-2mm，dtt?0.5-2mm，edta?3-8mm；

25、分離系統(tǒng)懸液的用量為1×107個細(xì)胞/1-10ml。

26、優(yōu)選的，步驟s3中，生物素的濃度為1-2.5mm；分離系統(tǒng)懸液與生物素的體積比為1:1-5。

27、根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種緩沖溶液，以pbs作為溶劑，并含有pmsf。

28、優(yōu)選的，上述緩沖溶液中，pmsf的濃度為0.5-2mm。

29、優(yōu)選的，上述緩沖溶液中含有dtt和edta。

30、優(yōu)選的，上述溶液中，dtt的濃度為0.5-2mm，edta的濃度為3-8mm。

31、相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明具有如下有益效果：

32、1.?采用微流控芯片實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體的分離和富集，方法操作簡單、分離快速，并且通過對表面結(jié)合有pmp70抗體的磁珠的利用，通過pmp70抗體與過氧化物酶體膜上的抗原結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對過氧化物酶體的分離和富集，特異性高，并能夠保證過氧化物酶體分離過程中的準(zhǔn)確度與靈敏度。

33、2.?采用緩沖溶液ⅰ處理磁珠，有助于維護(hù)過氧化氫物酶體完整性，降低氧化氫物酶體的破損程度，從而保證其在后續(xù)與pmp70抗體的結(jié)合效果，提高分離和富集效果。

34、3.?采用微流控芯片實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體的分離和富集，適用于對少量細(xì)胞過氧化物酶體的分離，試劑消耗量小，并且芯片中通過縮口的剪切作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解還可達(dá)到無菌分離的目的，對于后續(xù)無菌需求的研究具有潛在應(yīng)用價值

技術(shù)特征：

1.一種微流控芯片，其特征在于，包括芯片主體，所述芯片主體設(shè)有微流道，所述微流道包含有依次連通的裂解模塊（10）、孵育模塊（20）和分選模塊（30）；

2.一種基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，其特征在于，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于微流控芯片的過氧化物酶體分離富集方法，屬于細(xì)胞器分離技術(shù)領(lǐng)域，微流控芯片設(shè)有包含有依次連通的裂解模塊、孵育模塊和分選模塊的微流道，裂解模塊配置有若干縮口；細(xì)胞懸液進(jìn)入裂解模塊，流經(jīng)縮口時裂解，然后在孵育模塊與分離系統(tǒng)懸液混合，磁珠的表面結(jié)合有抗原、抗體或二抗，可與細(xì)胞裂解液中的物質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，然后在分選模塊通過磁體將磁珠以及結(jié)合在其表面的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離，通過生物素對其中的磁珠進(jìn)行競爭性洗脫，將磁珠與細(xì)胞裂解液中的物質(zhì)分離，實(shí)現(xiàn)對過氧化物酶體的分離富集。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確度與靈敏度高、特異性強(qiáng)，試劑消耗量小，可用于少量細(xì)胞過氧化物酶體的分離。

技術(shù)研發(fā)人員：周露萍,李阿麗,趙明,許良,劉明,覃江江,張航,朱帥,葉武,丁文,朱煥成
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6