本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種纖維素酶cell7及其制備、改造和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、纖維素酶是一類能催化水解纖維素生成葡萄糖、纖維二糖和纖維素低聚糖的復(fù)合酶，屬于糖苷水解酶(gh)家族。根據(jù)酶的作用方式和底物特異性分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和裂解多糖單加氧化酶，在食品行業(yè)、造紙制漿、生物燃料以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。木質(zhì)纖維生物質(zhì)中的纖維素經(jīng)水解可以轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的還原糖，經(jīng)過發(fā)酵處理轉(zhuǎn)化形成生物乙醇等綠色能源或其他化學(xué)產(chǎn)品，其中酶法降解纖維素是生物質(zhì)纖維素降解的一種重要的方法和手段。

2、纖維素分解酶來源廣泛，包括各種真菌、細(xì)菌以及植物和反芻草食動物。真菌作為研究最多的植物生物質(zhì)降解微生物，具有強(qiáng)大的胞外分泌酶的能力，纖維素分解真菌主要包括子囊菌門和擔(dān)子菌門。相比之下，細(xì)菌來源的纖維素分解酶研究較少，大多數(shù)細(xì)菌的纖維素分解酶來自芽孢桿菌、不動桿菌、梭狀芽孢桿菌和纖維素單胞菌等。多數(shù)真菌能夠同時降解結(jié)晶和無定形纖維素，而絕大多數(shù)細(xì)菌只能有效降解無定形結(jié)構(gòu)(如cmc)。目前，纖維素酶廣泛應(yīng)用于食品與飼料、造紙制漿、生物燃料等重要行業(yè)，尤其在生物醫(yī)藥行業(yè)纖維素酶表現(xiàn)出良好的抑菌性，對醫(yī)用植入物部位常見致病菌形成的生物膜表現(xiàn)出抑制作用，可以減少手術(shù)過程中的感染率。微生物是纖維素酶的主要生產(chǎn)者，而大多數(shù)纖維素降解菌產(chǎn)酶量低，存在酶催化效率低和熱穩(wěn)定性差等不足，限制工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用。

3、cbms結(jié)構(gòu)域具有與纖維素特異性相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，通常存在于n端或c端，通過一段高度糖基化的柔性連接肽與cd區(qū)連接，有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。cbm結(jié)構(gòu)域的核心作用在于識別并特異性地與不溶性纖維素進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合將纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域cd引導(dǎo)至纖維素底物，從而增強(qiáng)了纖維素酶對底物的親核性以及水解活性?；赾bm的功能特點(diǎn)，將不同來源的cbm與纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域融合重組以開發(fā)嵌合酶是改善酶的水解效率的一種有效手段。

4、為解決以上諸多因素對纖維素酶工業(yè)應(yīng)用的限制，通過構(gòu)建基因工程菌實(shí)現(xiàn)一種纖維素酶的異源表達(dá)，對提高纖維素酶的催化活性和穩(wěn)定性、探究酶-底物相互作用以及酶的應(yīng)用潛質(zhì)具有重要意義，進(jìn)而滿足工業(yè)生產(chǎn)所需。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種纖維素酶cell7及其制備、改造和應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種纖維素酶cell7，所述纖維素酶cell7的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、上述一種纖維素酶cell7的制備方法，在纖維素酶基因cell7兩端分別引入bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)，然后連接至pmd18-t載體，得到重組載體pmd18-t-cell7；重組載體pmd18-t-cell7和pet28a載體均經(jīng)bamhⅰ和xhoⅰ雙酶切，然后通過t4dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pet28a-cell7；將重組載體pet28a-cell7轉(zhuǎn)化宿主菌e.coil?bl21(de3)，得到重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7；對重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到纖維素酶cell7；

5、其中，所述纖維素酶基因cell7的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、上述一種纖維素酶cell7在如下任一種中的應(yīng)用：1)在降解羧甲基纖維素鈉中的應(yīng)用；2)在降解纖維二糖中的應(yīng)用；3)在降解木聚糖中的應(yīng)用；4)在制備促進(jìn)細(xì)菌生物膜分散的藥物中的應(yīng)用；

7、進(jìn)一步的，所述細(xì)菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

8、一種改造上述纖維素酶cell7的方法，將纖維素酶cell7與cbm3結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，得到改造纖維素酶cell7-cbm3；所述改造纖維素酶cell7-cbm3相較于纖維素酶c?ell7具有提高的比活力和ph穩(wěn)定性；

9、進(jìn)一步的，所述改造纖維素酶cell7-cbm3的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

10、進(jìn)一步的，所述方法具體為：利用overlap?pcr技術(shù)將纖維素酶基因cell7與cbm3結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼基因進(jìn)行融合，得到融合基因cell7-cbm3；融合基因cell7-cbm3和pet-28a載體均經(jīng)bamhⅰ和xhoⅰ雙酶切，然后通過t4dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pet28a-cell7-cbm3；將重組載體pet28a-cell7-cbm3轉(zhuǎn)化宿主菌e.coil?bl21(de3)，得到重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7-cbm3；對重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7-cbm3進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到改造纖維素酶cell7-cbm3；其中，所述融合基因cell7-cbm3的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

11、一種改造纖維素酶cell7-cbm3，其是由上述的方法改造得到。

12、上述一種改造纖維素酶cell7-cbm3在如下任一種中的應(yīng)用：1)在降解羧甲基纖維素鈉中的應(yīng)用；2)在降解纖維二糖中的應(yīng)用；3)在降解木聚糖中的應(yīng)用；4)在制備促進(jìn)細(xì)菌生物膜分散的藥物中的應(yīng)用；

13、進(jìn)一步的，所述細(xì)菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

14、本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

15、(1)本發(fā)明提供的纖維素酶cell7為糖苷水解酶gh5家族新成員，其堿基序列未匹配到相似的纖維素酶基因片段。

16、(2)本發(fā)明通過基因工程手段成功實(shí)現(xiàn)了纖維素酶cell7的異源表達(dá)，通過ni-nta瓊脂糖純化樹脂對cell7進(jìn)行分離純化后測得重組纖維素酶cell7比酶活力為2249.81u/mg，同時纖維素酶cell7可降解羧甲基纖維素鈉(cmc-na)、纖維二糖、木聚糖，主要作用于β-1,4-糖苷鍵，屬于內(nèi)切葡聚糖酶。

17、(3)本發(fā)明提供的纖維素酶cell7最適反應(yīng)溫度50℃，最適反應(yīng)ph為5.0，為中溫酸性酶。已有文獻(xiàn)表明纖維素酶作為糖苷水解酶可降解病原細(xì)菌如金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的胞外聚合物中的多糖物質(zhì)，靶向降解細(xì)菌eps中的β-1,4-糖苷鍵，從而誘導(dǎo)生物膜的擴(kuò)散，是臨床上解決生物膜感染的一種有效方法。因此，纖維素酶cell7具有良好的降解生物膜應(yīng)用前景。

18、(4)本發(fā)明通過將cbm3結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因添加至纖維素酶基因cell7的c末端，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pet28a-cell7-cbm3，成功構(gòu)建融合蛋白cell7-cbm3基因工程菌e.coilbl21(de3)-pet28a-cell7-cbm3。cell7-cbm3對cmc-na的比活力為2915.76u/mg，相比原酶的2249.81u/mg提高了1.3倍，其最適反應(yīng)溫度50℃，最適反應(yīng)ph為5.5。

技術(shù)特征：

1.一種纖維素酶cell7，其特征在于：所述纖維素酶cell7的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2.?如權(quán)利要求1所述的纖維素酶cell7的制備方法，其特征在于：在纖維素酶基因cell7兩端分別引入bamh?ⅰ和xho?ⅰ酶切位點(diǎn)，然后連接至pmd18-t載體，得到重組載體pmd18-t-cell7；重組載體pmd18-t-cell7和pet28a載體均經(jīng)bamh?ⅰ和xho?ⅰ雙酶切，然后通過t4?dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pet28a-cell7；將重組載體pet28a-cell7轉(zhuǎn)化宿主菌e.coil?bl21(de3)，得到重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7；對重組菌e.coilbl21(de3)-pet28a-cell7進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到纖維素酶cell7；

3.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶cell7在如下任一種中的應(yīng)用：1）在降解羧甲基纖維素鈉中的應(yīng)用；2）在降解纖維二糖中的應(yīng)用；3）在降解木聚糖中的應(yīng)用；4）在制備促進(jìn)細(xì)菌生物膜分散的藥物中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述細(xì)菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

5.一種改造權(quán)利要求1所述纖維素酶cell7的方法，其特征在于：將纖維素酶cell7與cbm3結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，得到改造纖維素酶cell7-cbm3；所述改造纖維素酶cell7-cbm3相較于纖維素酶cell7具有提高的比活力和ph穩(wěn)定性。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述改造纖維素酶cell7-cbm3的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

7.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：利用overlap?pcr技術(shù)將纖維素酶基因cell7與cbm3結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼基因進(jìn)行融合，得到融合基因cell7-cbm3；融合基因cell7-cbm3和pet-28a載體均經(jīng)bamh?ⅰ和xho?ⅰ雙酶切，然后通過t4?dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pet28a-cell7-cbm3；將重組載體pet28a-cell7-cbm3轉(zhuǎn)化宿主菌e.coil?bl21(de3)，得到重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7-cbm3；對重組菌e.coil?bl21(de3)-pet28a-cell7-cbm3進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到改造纖維素酶cell7-cbm3；

8.一種改造纖維素酶cell7-cbm3，其特征在于：由權(quán)利要求5~7任一項(xiàng)所述的方法改造得到。

9.如權(quán)利要求8所述的改造纖維素酶cell7-cbm3在如下任一種中的應(yīng)用：1）在降解羧甲基纖維素鈉中的應(yīng)用；2）在降解纖維二糖中的應(yīng)用；3）在降解木聚糖中的應(yīng)用；4）在制備促進(jìn)細(xì)菌生物膜分散的藥物中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述細(xì)菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種纖維素酶CelL7及其制備、改造和應(yīng)用。所述纖維素酶CelL7的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其對羧甲基纖維素鈉、纖維二糖和木聚糖均表現(xiàn)出降解能力，能夠促進(jìn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌生物膜分散。將所述纖維素酶CelL7與CBM3結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，得到改造纖維素酶CelL7?CBM3；所述改造纖維素酶CelL7?CBM3相較于纖維素酶CelL7具有提高的比活力和pH穩(wěn)定性。本發(fā)明具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：嚴(yán)芬,胡詩琦,翁曉敏,蔡佳琪,方婷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6