本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)，具體來說，涉及一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法。

背景技術(shù)：

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)作為一種多能成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化功能；通過旁分泌活性物質(zhì)如細(xì)胞因子、化學(xué)因子和調(diào)節(jié)分子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、炎癥控制、修復(fù)激活和再生重塑的生物學(xué)作用。其弱表達(dá)ii類主要組織相容性復(fù)合物(mhc-ii)和共刺激分子，這意味著異體或自體的mscs移植都不會(huì)引起醫(yī)藥水平的不良反應(yīng)，還具有強(qiáng)大的美容、抗衰老、治慢病和防病變的潛能。不同來源的mscs具有一些不同的生物學(xué)特性即異質(zhì)性，這樣會(huì)產(chǎn)生一定差異的治療效果；如臍帶來源的mscs具有較強(qiáng)的免疫抑制功能和炎癥控制能力。經(jīng)過馴化教育的mscs可獲得某些特異功能和更好的治療效果。

2、現(xiàn)有干細(xì)胞培養(yǎng)過程中難以去除污染的其它細(xì)胞和衰老的細(xì)胞，分離、挑選具有高表達(dá)干性基因和高增殖克隆能力的mscs亞群。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有干細(xì)胞培養(yǎng)過程中難以去除污染細(xì)胞和衰老細(xì)胞的問題，本發(fā)明提供了一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，包括步驟：

4、s1、在無菌的平皿中，放入含有100u/ml青霉素、100mg/l鏈霉素的醫(yī)用pbs，采用無菌處理方式獲取臍帶片段、剝?nèi)ネ獍难蚰ず蜕掀樱⑻蕹芎脱獕K，留下干凈的凝膠狀組織；

5、s2、在另一培養(yǎng)皿中，利用醫(yī)用pbs洗凈分離出的凝膠狀組織，然后剪成大小約2mm3大小的組織塊；

6、s3、將組織塊置于培養(yǎng)皿中，倒置盛放在4℃環(huán)境存放1-2小時(shí)后，再加入2ml低糖dmem/f12培養(yǎng)基，放置在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

7、s4、24h后再加等量的培養(yǎng)基，到5-7天后半量換液，此后每隔3天半量換液1次，觀察貼壁組織周圍的細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到85％左右融合度時(shí)，可消化傳代；

8、s5、利用trypleexpress胰酶替代物消化細(xì)胞，放置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進(jìn)行消化，使細(xì)胞脫離懸??；

9、s6、加入同量的醫(yī)用pbs，采用吸管吹吸成單細(xì)胞懸液，加入離心管；

10、s7、預(yù)接種的單細(xì)胞懸液在15cm培養(yǎng)皿中30分鐘，去除大于目標(biāo)細(xì)胞的大細(xì)胞、雜細(xì)胞和吸附性強(qiáng)的細(xì)胞，收集全部未貼壁的細(xì)胞懸液，從中吸出0.5ml用于臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)；

11、s8、用計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，以5000/cm2密度接種到新的培養(yǎng)瓶里，于5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h；

12、s9、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85-90％時(shí)，可消化傳代。

13、進(jìn)一步地，步驟s1中無菌處理方式具體包括：采用無菌手術(shù)剪把臍帶剪切成2.0cm左右的片段，無菌尖頭鑷將外包的羊膜和上皮層剝?nèi)ズ褪中g(shù)刀縱切開臍帶，剔除血管和血塊。

14、進(jìn)一步地，步驟s5中使細(xì)胞脫離懸浮具體方式：消化2～5min后，把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，輕拍培養(yǎng)皿底部，促使細(xì)胞脫離懸浮。

15、進(jìn)一步地，步驟s6中離心管內(nèi)環(huán)境：將單細(xì)胞懸液以1200r.p.m，離心5min，吸除上清液，加入10ml低糖dmem/f12培養(yǎng)基。

16、進(jìn)一步地，還包括步驟s10、重復(fù)步驟s8和步驟s9操作3次后，在第4次在5％co2，37oc培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h后，加入一支znb-賦能因子于低氧環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)12h后用上清液終止消化，收集離散的懸浮細(xì)胞，離心，1200r.min，5min，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)和質(zhì)量檢測(cè)，待檢測(cè)合格后放行使用。

17、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)，具有如下有益效果：

18、本發(fā)明解決了分離、挑選具有高表達(dá)干性基因和高增殖克隆能力的mscs亞群，去除污染的其它細(xì)胞和衰老的細(xì)胞，使用于擴(kuò)增的mscs群體更加形態(tài)均一和功能一致控制絕大多數(shù)mscs獲得一致長度的細(xì)胞周期可減少異質(zhì)性，本培養(yǎng)方法具有更好的抗凋亡能力，遷移能力，調(diào)節(jié)能力，控炎能力，激活能力及修復(fù)能力。

技術(shù)特征：

1.一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，其特征在于，包括步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，其特征在于，步驟s1中無菌處理方式具體包括：采用無菌手術(shù)剪把臍帶剪切成2.0cm左右的片段，無菌尖頭鑷將外包的羊膜和上皮層剝?nèi)ズ褪中g(shù)刀縱切開臍帶，剔除血管和血塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，其特征在于，步驟s5中使細(xì)胞脫離懸浮具體方式：消化2～5min后，把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，輕拍培養(yǎng)皿底部，促使細(xì)胞脫離懸浮。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，其特征在于，步驟s6中離心管內(nèi)環(huán)境：將單細(xì)胞懸液以1200r.p.m，離心5min，吸除上清液，加入10ml低糖dmem/f12培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，其特征在于，還包括步驟s10、重復(fù)步驟s8和步驟s9操作3次后，在第4次在5％co2，37oc培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h后，加入一支znb-賦能因子于低氧環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)12h后用上清液終止消化，收集離散的懸浮細(xì)胞，離心5min，離心速率1200r.min，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)和質(zhì)量檢測(cè)，待檢測(cè)合格后放行使用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種給間充質(zhì)干細(xì)胞賦能的方法，本方法能控制其細(xì)胞大小，每份細(xì)胞直徑小于15um，易通過毛細(xì)血管，無血管栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。每份細(xì)胞存活率大于98％，死細(xì)胞很少，賦能MSCs具有抵御不同免疫細(xì)胞的攻擊能力，如巨噬細(xì)胞、補(bǔ)體、凝血因子、NK和T細(xì)胞，高表達(dá)趨化因子和血管識(shí)別分子，具有很好的與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的能力，高表達(dá)抗凋亡分子，可抵抗惡劣微環(huán)境的不良因素的影響如低氧、高炎、高自由基等。分離、挑選具有高表達(dá)干性基因和高增殖克隆能力的MSCs亞群，去除污染的其它細(xì)胞和衰老的細(xì)胞，使用于擴(kuò)增的MSCs群體更加形態(tài)均一和功能一致控制絕大多數(shù)MSCs獲得一致長度的細(xì)胞周期可減少異質(zhì)性。

技術(shù)研發(fā)人員：殷勤偉,何恒,李嘉衛(wèi),廖鈺婷,張明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華研（深圳）再生醫(yī)學(xué)集團(tuán)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6