本發(fā)明涉及酶及蛋白結(jié)構(gòu)領(lǐng)域，具體為一種融合蛋白酶、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、全球每年需要超過1.18億次獻(xiàn)血才能滿足輸血需求(solvent?extraction&ionexchange?2015,33(3),224-235.)。正確的血型匹配對(duì)于安全輸血至關(guān)重要，因?yàn)椴幌嗳莸妮斞獣?huì)觸發(fā)補(bǔ)體激活和紅細(xì)胞溶血，可能導(dǎo)致病人輸血相關(guān)的死亡(transfusionclinique?et?biologique?2019,26(2),116-124.)。在血型系統(tǒng)中，abo抗原最具免疫原性。血型為a、b和o的個(gè)體在其紅細(xì)胞膜上分別表達(dá)a、b和h抗原(vox?sang?1967,12(5),321-328.)。值得注意的是，o型紅細(xì)胞缺乏免疫原性的糖類，如a抗原中的α-n-乙酰半乳糖(galnac)和b抗原中的半乳糖(gal)。這種抗原缺乏使得o型紅細(xì)胞不會(huì)與a型和b型個(gè)體的抗a或抗b抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，因此o型血個(gè)體也被稱為“萬能供血者”。充足的o型紅細(xì)胞供應(yīng)對(duì)于緊急情況輸血至關(guān)重要，尤其是在受血者血型未知或供血者有限的情況下，例如戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境、兒科輸血或血液短缺時(shí)。

2、o型紅細(xì)胞可以通過酶催化去除galnac或gal分子從a型或b型細(xì)胞中生成(science?1982,215(4529),168-170.)。歷史上，b型血到o型血的轉(zhuǎn)換比a型血到o型血的轉(zhuǎn)換吸引著更多的研究關(guān)注，這是因?yàn)閍抗原存在多個(gè)亞型，如a1型和a2型(vox?sang?1989,56(1),1-20.)。1980年，lenny等科學(xué)家首次使用綠咖啡豆的α-半乳糖苷酶催化去除末端抗原gal，首次將b型血轉(zhuǎn)化為o型。臨床研究表明，b型到o型轉(zhuǎn)換的紅細(xì)胞在安全性和有效性上與天然的o型紅細(xì)胞相當(dāng)。然而，所需的高濃度酶量(每單位紅細(xì)胞需要1-2g酶)是將此技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床的主要障礙(science?1982,215(4529),168-170.)，這個(gè)障礙突顯出需要更高效的酶來推進(jìn)萬能o型紅細(xì)胞的產(chǎn)生。

3、最近的研究發(fā)現(xiàn)來自細(xì)菌來源的更高效的α-n-乙酰氨基半乳糖苷酶(α-galnacases)和α-半乳糖苷酶(nat?biotechnol?2007,25(4),454-464.；nat?microbiol2024,9(5),1176-1188.；nat?microbiol?2019,4(9),1475-1485.)。來自腦膜敗血伊麗莎白菌(elizabethkingia?meningosepticum)的α-galnacase和來自脆弱擬桿菌(bacteriodesfragilis)的α-半乳糖苷酶被發(fā)現(xiàn)每單位a型和b型紅細(xì)胞分別需要約60mg和約2mg(natbiotechnol?2007,25(4),454-464.)。最近，來自阿克曼菌(akkermansia?muciniphila)的酶amgh36a和amgh110a顯示出高效切割a1、擴(kuò)展的a抗原和b抗原，每單位紅細(xì)胞分別需要18mg和8mg。然而，通過amgh36a從a型紅細(xì)胞產(chǎn)生的o型紅細(xì)胞仍顯示出與o型血漿的某些交叉反應(yīng)性(nat?microbiol?2024,9(5),1176-1188.)。

4、另一個(gè)來自普氏梭桿菌(flavonifractor?plautii)的雙酶系統(tǒng)，利用n-乙酰氨基半乳糖脫乙酰酶(fpgalnacdeac)和半乳糖苷酶(fpgalnase)，二者協(xié)同作用高效切割a抗原，從而實(shí)現(xiàn)高效的a型紅細(xì)胞到o型紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。fpgalnacdeac首先去除galnac的n-乙酰基團(tuán)生成半乳糖胺，隨后由fpgalnase切割半乳糖胺暴露出h抗原(nat?microbiol?2019,4(9),1475-1485.)。盡管這兩種酶的協(xié)同作用具有極大的潛力，但是目前這種酶系統(tǒng)在臨床上的應(yīng)用尚未得到探索，迫切需要設(shè)計(jì)更高效的酶變體以提高臨床實(shí)用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

2、一種融合蛋白酶的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法為：將fpgalnacdeac與fpgalnase進(jìn)行基因重組，經(jīng)原核表達(dá)、純化獲得的fpgalnacdeac-fpgalnase或fpgalnase-fpgalnacdeac。

3、進(jìn)一步地，所述基因重組的具體步驟為：

4、s1、根據(jù)fpgalnacdeac和fpgalnase氨基酸序列，分別設(shè)計(jì)合成了pcr擴(kuò)增所需的前、后向引物；

5、s2、從普氏梭桿菌中克隆fpgalnacdeac及fpgalnase的dna片段，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離pcr產(chǎn)物后，通過dna膠回收試劑盒回收目的片段；

6、s3、經(jīng)sanger法測(cè)序后與ncbi發(fā)表的序列進(jìn)行比對(duì)分析；

7、s4、將測(cè)序正確的目的片段氨基酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，添加5'ncoi和3'xhoi，使用基因重組的方法將基因通過5'ncoi和3'xhoi克隆至載體pet-25b，his6作為純化標(biāo)簽；

8、s5、將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21大腸桿菌中，用iptg誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)；

9、s6、將菌體裂解后依次使用ni柱、凝膠色譜柱進(jìn)行蛋白純化，獲得高產(chǎn)量、高純度的重組蛋白。

10、進(jìn)一步地，所述fpgalnacdeac的序列為seq?id?no.1。

11、進(jìn)一步地，所述fpgalnase的序列為seq?id?no.2。

12、一種融合蛋白酶由上述所述的融合蛋白酶的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

13、一種融合蛋白酶用于將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

14、進(jìn)一步地，將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞的具體操作步驟為：將fpgalnacdeac-fpgalnase或fpgalnase-fpgalnacdeac融合蛋白與a型紅細(xì)胞共同孵育一定時(shí)間后，即可將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

15、一種含上述所述的融合蛋白酶的試劑，所述試劑用于將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、1、本發(fā)明制備的蛋白酶fpgalnacdeac，fpgalnase在優(yōu)化的孵育時(shí)間、酶濃度和緩沖體系中與a型紅細(xì)胞孵育后，能以極低的濃度達(dá)到近乎100％的抗原轉(zhuǎn)化效率，及a-to-o紅細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)變，且轉(zhuǎn)變后紅細(xì)胞形態(tài)、功能幾乎不發(fā)生異常改變。

18、2、本發(fā)明首次解析了fpgalnase的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，確定了催化中心位點(diǎn)并驗(yàn)證了其活性，為兩種蛋白酶的再設(shè)計(jì)工作提供了理論依據(jù)。

19、3、本發(fā)明制備的融合蛋白fpgalnacdeac-fpgalnase或fpgalnase-fpgalnacdeac在更低的工作濃度及孵育時(shí)間具有近乎100％的a-to-o轉(zhuǎn)換，表明其具備更高的催化活性，顯示出酶再設(shè)計(jì)工作的必要性，和對(duì)臨床輸血應(yīng)用的重要性。

技術(shù)特征：

1.一種融合蛋白酶的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法為：將fpgalnacdeac與fpgalnase進(jìn)行基因重組，經(jīng)原核表達(dá)、純化獲得的fpgalnacdeac-fpgalnase或fpgalnase-fpgalnacdeac。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白酶的構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因重組的具體步驟為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白酶的構(gòu)建方法，其特征在于，所述fpgalnacdeac的序列為seq?id?no.1。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白酶的構(gòu)建方法，其特征在于，所述fpgalnase的序列為seq?id?no.2。

5.一種融合蛋白酶由權(quán)利要求1～4任一所述的融合蛋白酶的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

6.如權(quán)利要求5所述的一種融合蛋白酶用于將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞的具體操作步驟為：將fpgalnacdeac-fpgalnase或fpgalnase-fpgalnacdeac融合蛋白與a型紅細(xì)胞共同孵育一定時(shí)間后，即可將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

8.一種含有權(quán)利要求5所述的融合蛋白酶的試劑，其特征在于，所述試劑用于將a型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閛型紅細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及酶及蛋白結(jié)構(gòu)領(lǐng)域，具體為一種融合蛋白酶、構(gòu)建方法及應(yīng)用。所述構(gòu)建方法為：將FpGalNAcDeAc與FpGalNase進(jìn)行基因重組，經(jīng)原核表達(dá)、純化獲得的FpGalNAcDeAc?FpGalNase或FpGalNase?FpGalNAcDeAc。本發(fā)明描述了在特定的緩沖溶液、孵育時(shí)間、酶濃度條件下，可以將A型紅細(xì)胞最大效率的轉(zhuǎn)換為“通用型”O(jiān)型紅細(xì)胞。利用冷凍電鏡解析了半乳糖胺酶的結(jié)構(gòu)，并將乙酰半乳糖胺去乙酰酶與半乳糖胺酶進(jìn)行融合表達(dá)，進(jìn)行更高效的紅細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換。本發(fā)明能快速、高效、安全的進(jìn)行A型紅細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換，具有蛋白酶產(chǎn)量高、工作濃度低、轉(zhuǎn)換操作簡(jiǎn)便、條件普適、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：吳國(guó)球,周美玲,門玉樂,雒凱珊,蘇朝,韓鵬程,孫艷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6