本發(fā)明屬于生物工程，尤其是一種過(guò)表達(dá)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（lpat）基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、dha的有效吸收率與dha存儲(chǔ)形式密切相關(guān)，市場(chǎng)上普遍銷售的高純度?dha主要是通過(guò)加工魚油獲得的乙酯型（ethyl?ester,?ee）dha，人體對(duì)ee-dha?的有效吸收率只有21%。不僅如此，ee-dha?由于在利用過(guò)程中會(huì)分解形成乙醇，可能會(huì)引起兒童及一些存在身體疾病人群的不良反應(yīng)，天然藻油dha主要以甘油三酯（tag）的形態(tài)存在，人體對(duì)tag-dha的綜合有效吸收率為?57%，而tag?sn-2位?dha?的有效吸收率接近100%。

2、裂殖壺菌是一種異養(yǎng)且富含脂質(zhì)的海洋生物，具有巨大的脂質(zhì)化合物生產(chǎn)潛力。裂殖壺菌積累的油脂中，有50%左右為dha，因此被認(rèn)為是最適合量產(chǎn)dha油脂的微生物。

3、生產(chǎn)sn-2?dha的方法包括生物合成法、化學(xué)法、化學(xué)酶法和酶解法，與其他方法相比，生物合成法是根據(jù)脂肪酸的代謝特性進(jìn)行特異性調(diào)控的，沒(méi)有生產(chǎn)成本高昂、副反應(yīng)多、催化劑毒性等問(wèn)題。但利用生物合成法生產(chǎn)sn-2?dha，缺少一個(gè)高效的生產(chǎn)底盤，因此實(shí)現(xiàn)sn-2?dha高效生產(chǎn)的關(guān)鍵是構(gòu)建一個(gè)高產(chǎn)sn-2?dha的裂殖壺菌工程菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種過(guò)表達(dá)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（lpat）基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種過(guò)表達(dá)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株，所述基因工程菌株是由schizochytrium?sp.?hx-308菌株構(gòu)建而成，所述基因工程菌株能夠過(guò)表達(dá)dha儲(chǔ)存途徑中的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因lpat。

4、進(jìn)一步地，所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因lpat的基因序列為seq?id?no.13、seqid?no.14、seq?id?no.16、seq?id?no.17或seq?id?no.18。

5、一種如上所述的裂殖壺菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

6、（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒pzpk-g418-lpat：

7、克隆來(lái)源于schizochytrium?sp.?hx-308的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因lpat，并通過(guò)基因同源重組技術(shù)將該基因插入質(zhì)粒中，構(gòu)建得過(guò)表達(dá)載體pzpk-g418-lpat；

8、（2）構(gòu)建裂殖壺菌基因工程菌株：

9、利用電轉(zhuǎn)化法將線性化后的過(guò)表達(dá)載體pzpk-g418-lpat電轉(zhuǎn)導(dǎo)入schizochytrium?sp.?hx-308，即得所述裂殖壺菌基因工程菌株。

10、進(jìn)一步地，所述過(guò)表達(dá)載體pzpk-g418-lpat的構(gòu)建方法包括依次進(jìn)行的如下步驟:

11、1）根據(jù)裂殖壺菌schizochytrium?sp.?hx-308的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因lpat的序列設(shè)計(jì)引物，利用pcr擴(kuò)增技術(shù)獲取溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因lpat片段；

12、2）用限制性內(nèi)切酶hind?ⅲ于37℃條件下單酶切載體質(zhì)粒pzpk，酶切反應(yīng)4h，將酶切產(chǎn)物膠回收；

13、3）連接溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因lpat片段與酶切后產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，即得所述過(guò)表達(dá)載體pzpk-g418-lpat。

14、如上所述的裂殖壺菌基因工程菌株在生產(chǎn)sn-2?dha中的應(yīng)用。

15、利用如上所述的裂殖壺菌基因工程菌株高效積累生產(chǎn)sn-2?dha的方法，包括如下步驟：

16、將裂殖壺菌基因工程菌株菌種接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得一代種子；取所述一代種子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得二代種子；取所述二代種子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得三代種子，作為發(fā)酵用菌種；將發(fā)酵用菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體提取脂質(zhì)，進(jìn)一步提取sn-2?dha，得到sn-2?dha。

17、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)的條件為25～30℃，150～250r/min振搖培養(yǎng)。

18、進(jìn)一步地，所述收集菌體提取脂質(zhì)的方法包括如下步驟：

19、1）向發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中加入naoh溶液調(diào)ph?10-13后，加入發(fā)酵液質(zhì)量0.01-0.5%的破壁酶，40~60℃，100～200r/min振蕩5~15h；

20、2）冷卻至室溫，加入與發(fā)酵液等體積的無(wú)水乙醇失活破壁酶；

21、3）加入正己烷萃取，收集上層有機(jī)相；

22、4）重復(fù)步驟3）若干次，合并有機(jī)相，揮干溶劑，得到含dha的脂質(zhì)，進(jìn)行稱量。

23、進(jìn)一步地，所述提取sn-2?dha的方法包括如下步驟：

24、（1）去除磷脂

25、1）將提取的脂質(zhì)置于瓶中封口，在水浴鍋中加熱至90℃時(shí)進(jìn)行過(guò)濾/抽濾，去除不溶物；

26、2）稱取樣品，加熱至80℃，加超純水，樣品：超純水的比例g：ml為1：1，充分?jǐn)嚢枋怪?/p>

27、3）離心管離心沉淀，上層為甘油脂，中層為磷脂，下層為水相，收集上層甘油酯。

28、（2）制備2-甘油單酯

29、1）在反應(yīng)釜中加入dha油脂即上層甘油酯和無(wú)水乙醇，隨后加入質(zhì)量濃度為3%的脂肪酶啟動(dòng)醇解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為23℃，350?r/min下連續(xù)攪拌4h；

30、2）將反應(yīng)混合物12000rpm離心1min后，過(guò)有機(jī)濾膜除去脂肪酶；

31、3）將產(chǎn)物溶解于正己烷中，然后加入75%乙醇-水溶液，將混合溶液轉(zhuǎn)移到分離漏斗中靜置分層；

32、4）形成兩層后，去除含有酯類和未反應(yīng)甘油三酯殘基上層，保留含2-mag的萃取層；

33、5）在含2-mag的萃取層加入混合溶液，混合溶液為按照體積比為?9：1混合的乙醇和正己烷的混合溶液，以3500?r/min的速度離心1min，吸取上層含有2-mag?的正己烷相，得到sn-2?dha；

34、其中，樣品：dha?油脂：無(wú)水乙醇：脂肪酶：步驟3）中正己烷：75%乙醇-水溶液：乙醇和正己烷的混合溶液的比例g：g：?g：g：ml：ml：ml為2：1：4：0.03：15：6：10。

35、進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的ph值為6.0～6.6，且包括：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸鈉?5g/l，硫酸鎂2?g/l，硫酸銨6?g/l，氯化鉀1?g/l，氯化鈣0.1?g/l，硫酸鉀0.6g/l，磷酸二氫鉀1?g/l，谷氨酸鈉?10g/l，0.1%的微量礦物質(zhì)，維生素b6?5?mg/l、維生素b120.5?mg/l，溶劑為水；上述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；其中，微量礦物質(zhì)的配方為：mncl2?8g/l、znso4?8g/l、cocl2?0.1g/l、n-甲基嗎啉氧化物namo?0.1g/l、cuso4?6g/l、niso4?6g/l、feso4?20g/l、濃h2so4?10ml/l，溶劑為水；

36、所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6.0～7.5，且包括：葡萄糖80g/l，酵母浸粉10g/l，硫酸鈉?10g/l，硫酸鎂2?g/l，硫酸銨6?g/l，氯化鉀1?g/l，氯化鈣0.1?g/l，硫酸鉀0.6?g/l，磷酸二氫鉀1?g/l，谷氨酸鈉?20?g/l，0.1%的微量礦物質(zhì)，維生素b6?5?mg/l、維生素b12?0.5?mg/l，溶劑為水；上述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；其中，微量礦物質(zhì)的配方為：mncl2?8g/l、znso4?8g/l、cocl2?0.1g/l、n-甲基嗎啉氧化物namo?0.1g/l、cuso4?6g/l、niso4?6g/l、feso4?20g/l、濃h2so4?10ml/l，溶劑為水。

37、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

38、1、本發(fā)明選用的裂殖壺菌hx-308底盤細(xì)胞具有巨大的dha生產(chǎn)潛力。

39、2、本發(fā)明采用合成生物學(xué)的思路，解析關(guān)鍵靶基因及其調(diào)控機(jī)制，優(yōu)化sn-2?dha儲(chǔ)存途徑，提高sn-2?dha積累效率，具有良好的應(yīng)用前景。

40、3、本發(fā)明通過(guò)對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌積累sn-2dha功能的增強(qiáng)源于溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。

41、4、本發(fā)明通過(guò)在裂殖壺菌野生型中過(guò)表達(dá)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lpat)基因獲得裂殖壺菌lpat工程菌，可以明顯提高sn-2?dha的積累，這為該菌株工業(yè)化定向合成sn-2dha提供了基礎(chǔ)。

42、5、本發(fā)明構(gòu)建了6個(gè)lpat工程菌株，其中l(wèi)pat2效果最佳，sn-2?dha產(chǎn)量相較野生型菌株提高70%以上。