本發(fā)明涉及葡聚糖磷酸化酶突變體，尤其涉及煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶的單位點突變體及其在生物轉化淀粉中的應用，屬于葡聚糖磷酸化酶突變體及其應用領域。

背景技術：

1、碳水化合物、蛋白質和脂肪是人類飲食中的三種主要營養(yǎng)素，平衡它們的比例對于預防慢性疾病至關重要，如肥胖、ii型糖尿病、心血管疾病、高血壓和癌癥。良好的飲食結構應包含緩慢代謝的淀粉，這對預防慢性疾病至關重要。

2、纖維素是植物細胞壁的支撐材料，也是地球上最豐富的碳水化合物。全球農業(yè)每年產生的木質纖維素生物量約為2000億噸，纖維素約占40%，每年生產800億噸纖維素；相比之下，全球谷物年產量約為27億噸，它含有約75%的淀粉，每年收獲20億噸淀粉作為食物和飼料。因此，作為食物/飼料的年度纖維素資源與淀粉的比例約為40。直鏈淀粉是通過α-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖，而纖維素是通過β-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖。人類可以消化α-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖（淀粉），但不能消化β-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖（纖維素），這是人體內缺乏纖維素水解酶的緣故。將β-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖酶促生物轉化為α-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖以利用非食品生物質生產淀粉具有應用前景。

3、高效利用農業(yè)廢棄物資源特別是將纖維素廢棄資源高效轉化為人造糧食則是緩解糧食危機，實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。合成生物技術的快速發(fā)展使人們打破自然合成路徑，創(chuàng)建高效人工生物合成體系成為可能，也為實現(xiàn)基于木質纖維素原料的人造淀粉高效生物合成提供了強有力的技術保障。

4、在前期研究中，本發(fā)明人與中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所的張以恒研究員合作開發(fā)了一種新的基于木質纖維素的生物精煉技術，可以生產人造食品（即，淀粉和蛋白質這兩種最重要的食物成分），以應對迫在眉睫的糧食危機，該技術改進了酶解糖化玉米秸稈的工藝，使用成本最低的商品化纖維素酶混合物，有效去除混合物中的β-葡萄糖苷酶（bg），使用纖維素-酶-酵母復合物減輕產物抑制并將其應用于預處理玉米秸稈。研究表明，去除纖維素酶組分中的β-葡聚糖酶（bg）只需要內切葡聚糖酶（egs）和纖維素生物水解酶（cbhs）就能將纖維素水解成纖維素二糖。在纖維素二糖磷酸化酶（cbp）的作用下轉化為葡萄糖1-磷酸和葡萄糖，葡萄糖可被釀酒酵母細胞用于生產微生物蛋白，葡萄糖1-磷酸可被馬鈴薯來源的α-葡聚糖磷酸化酶（pgp）進一步催化生產人工淀粉。

5、纖維素體外無輔酶生物轉化為淀粉包括三個步驟：首先，使用不含bg的纖維素酶混合物將纖維素部分水解為纖維二糖；其次，在磷酸鹽存在下，cbp將纖維二糖轉化為葡萄糖1-磷酸和葡萄糖；第三，來自葡萄糖1-磷酸的一個葡萄糖單元被添加到直鏈淀粉的非還原端。磷酸鹽在cbp和pgp之間循環(huán)的反應由pgp催化，這種整合的生物工藝在纖維素向淀粉的生物轉化中具有很高的能源效率，并且不會浪費纖維素中的任何葡萄糖單位。然而，目前該系統(tǒng)中酶的使用成本仍較高。如何進一步提高酶元件催化性能，降低酶的生產和使用成本，提高體系的轉化效率，將直接決定該技術的產業(yè)化可行性。

6、酶元件是體外多酶分子機器生物制造的核心，也是新生物煉制工廠的關鍵和核心?，F(xiàn)有的纖維素制淀粉的關鍵酶元件不同程度的存在催化效率低、穩(wěn)定性和適配性差或異源表達難等問題，有待改進。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供是煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體；

2、本發(fā)明的目的之二是提供所述煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體的編碼基因。

3、本發(fā)明的目的之三是提供含有所述突變體的編碼基因的表達盒、重組表達載體或含有所述重組表達載體的重組宿主細胞；

4、本發(fā)明的目的之四是將所述的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體、其編碼基因、含有所述突變體的編碼基因的表達盒、重組表達載體或含有所述重組表達載體的重組宿主細胞等應用于淀粉的合成或生物轉化。

5、本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

6、本發(fā)明的一方面是提供了煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體，該單位點突變體是將氨基酸序列為seq?id?no.1所示的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5進行e535v單位點突變所獲得的單位點突變體，其氨基酸序列為seqid?no.2所示。

7、本發(fā)明中所述單位點突變體“e535v”表示將氨基酸序列為seq?id?no.1所示的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的第535位氨基酸由谷氨酸（e）突變成纈氨酸（v）；本發(fā)明其余的單位點突變的表述依此類推。

8、本發(fā)明的另一方面是提供了煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的編碼基因。

9、本發(fā)明的另一方面是含有所述煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的編碼基因的表達盒、重組表達載體或含有所述重組表達載體的重組宿主細胞；其中，所述重組表達載體可以為重組原核表達載體或重組真核載體。

10、本發(fā)明進一步提供了制備任何一項所述煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的方法，包括：

11、（1）將所述煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的編碼基因可操作的與表達調控元件連接構建得到重組表達載體；

12、（2）將重組表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)宿主細胞，誘導表達重組蛋白，純化，即得。

13、為了提高所述煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的表達或純化效率；優(yōu)選的，步驟（1）中將煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體的編碼基因的前端加上一段dockerin序列（agtactaaactatacggcgacgttaatgacgacggcaaagtgaattcaaccgatgcagtggcattaaagcgatacgtcttacgttctggaatatccatcaataccgacaatgccgatctcaacgaagacggtcgggttaatagtaccgaccttggcatactcaagagatacattctgaaagaaatagatactctgccttacaagaat（seq?id?no.3））后再與表達調控元件連接構建得到重組原核表達載體；含有cbm3（纖維素結合結構域）的蛋白能夠由于cbm3對纖維素表面的高親和力吸附而緊密結合在纖維素表面，所以與纖維素結合上的含cbm3結構域蛋白或復合物可以通過高速離心從水溶液中分離出來；通過實驗在大腸桿菌bl21?(de3)?中表達了一種重組蛋白——mini-scaffoldin；合成蛋白mini-scaffoldin包含了一個cbm3結構域和三個不同的結合模塊cipa、cbpa和scab。由于結合模塊和dockerin之間的高親和性相互作用，蛋白與mini-scaffoldin可以組裝成一個酶復合物，此復合物可以通過mini-scaffoldin的cbm3結構域與再生無定形纖維素（rac）進行較好的吸附，最后通過高速離心實現(xiàn)對粗酶液中的蛋白的選擇性回收。

14、優(yōu)選的，步驟（2）中在進行純化時的方法優(yōu)選為：將誘導宿主細胞表達的酶粗液產物中加入微晶纖維素后離心，收集沉淀用0.5?mol?edta重懸后再離心，取上清，即得純化的蛋白；將誘導宿主細胞表達的酶粗液產物中加入微晶纖維素后得到吸附在微晶纖維素上的酶與mini-scaffoldin復合物，將微晶纖維素與酶以及mini-scaffoldin復合物離心后得到的沉淀用0.5mol?edta重懸后再離心可以使得mini-scaffoldin與突變體蛋白上的dockerin結構解離，由于mini-scaffoldin與微晶纖維素吸附不受影響，所以離心后沉淀為微晶纖維素和mini-scaffoldin，上清中是αgp蛋白，實現(xiàn)了對于酶粗液中突變體蛋白選擇性的高效回收。

15、本發(fā)明的再一方面是將所述的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體、其編碼基因、含有所述單位點突變體的編碼基因的表達盒、重組表達載體或含有所述重組表達載體的重組宿主細胞等應用于淀粉的合成或生物轉化。

16、本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實施方案，本發(fā)明提供了一種將所述的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體應用于合成淀粉中的應用，包括：以纖維二糖為底物，以所述的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點突變體為轉化酶進行酶促生物轉化反應得到淀粉；更優(yōu)選的，所述的轉化酶中還含有纖維素二糖磷酸化酶。

17、本發(fā)明針對纖維素制淀粉的關鍵酶元件存在的催化效率低、穩(wěn)定性和適配性差、異源表達難等問題，通過宏基因組和公共數據庫的大數據分析及生物信息學方法，精準挖掘新型纖維素降解和淀粉合成關鍵酶元件，挖掘鑒定得到來自煙草的新型α-葡聚糖磷酸化酶蛋白（αgp-5cc5）較土豆來源的α-葡聚糖磷酸化酶蛋白（pgp）具有更好的酶活及淀粉合成功能；在此基礎上，本發(fā)明進一步對挖掘鑒定的煙草來源的αgp-?5cc5的cap結構域進行單位點突變，結果發(fā)現(xiàn)，將氨基酸序列為seqid?no.1所示的煙草來源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5進行e535v單位點突變所獲得的單位點突變體，其酶活以及表達量均顯著高于野生型α-葡聚糖磷酸化酶。

18、本發(fā)明所涉及到的術語定義

19、除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。

20、術語“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括pna（肽核酸）、在反義技術中所用的dna類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡并密碼子取代）和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選（或所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代（ mol?cell.?probes8:91-98?(1994)）。

21、術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。即，針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術語適用于天然產生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白（即抗原），其中氨基酸殘基經由共價肽鍵連接。

22、術語“突變”和“突變體”在此具有它們的常用含義，指的是在核酸或多肽序列中的遺傳的、天然存在的或引入的變化，它們的意義與本領域人員通常所知的意義相同。

23、術語“重組宿主細胞株”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。

24、術語“可操作的連接”指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。

25、術語“轉化”指將編碼基因導入到宿主細胞內部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳轉化到宿主細胞中。

26、術語“表達”：內源性基因或轉基因在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。